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微生物菌種如何培養

發布時間:2022-11-22 21:14:23

1. 微生物培養需要什麼條件

微生物的實驗室培養:
營養構成:
各種培養基一般都含有水、碳源、氮源、無機鹽,此外還要滿足微生物生長對pH、特殊營養物質以及氧氣的要求。
無菌技術:
(1)關鍵:防止外來雜菌的入侵。
(2)具體操作
①對實驗操作的空間、操作者的衣著和手進行清潔和消毒。
②將用於微生物培養的器皿、接種用具和培養基等進行滅菌。
③為避免周圍環境中微生物的污染,實驗操作應在酒精燈火焰附近進行。
④實驗操作時應避免已經滅菌處理的材料用具與周圍的物品接觸。
(3)消毒和滅菌
制備牛肉膏蛋白腖固體培養基的方法:計算、稱量、溶化、滅菌、倒平板。
接種方法:
平板劃線法和稀釋塗布法。
(1)平板劃線操作:
①挑取他含菌樣品:選用平整、圓滑的接種環,按無菌操作法挑取少量菌種。
②劃A區:將平板倒置於煤氣(酒精)燈旁,左手拿出皿底並盡量使平板垂直於桌面,有培養基一面向著煤氣燈(這時皿蓋朝上,仍留在煤氣燈旁),右手拿接種環先在A區劃3—4條連續的平行線(線條多少應依挑菌量的多少面定)。劃完A區後應立即燒掉環上的殘菌,以免因菌過多而影響後面各區的分離效果。在燒接種環時,左手持皿底並將其覆蓋在皿蓋上方(不要放入皿蓋內),以防止雜菌的污染。
③劃其他區:將燒去殘菌後的接種環在平板培養基邊緣冷卻一下,並使B區轉到上方,接種環通過A區(菌源區)將菌帶到B區,隨即劃數條緻密的平行線。再從B區作C區的劃線。最後經C區作D區的劃線,D區的線條應與A區平行,但劃D區時切勿重新接觸A、B區,以免極該兩區中濃密的菌液帶到D區,影響單菌落的形成。隨即將皿底放入皿蓋中。燒去接種環上的殘菌。
④等平板凝固後,將平板倒置。
(2)稀釋塗布法:是將菌液進行一系列的梯度稀釋,然後將不同稀釋度的菌液分別塗布到瓊脂固體培養基的表面,在適宜條件下培養。在稀釋度足夠高的菌液里,聚集在一起的微生物將被分散成單個細胞,從而能在培養基表面形成單個的菌落。能夠測定樣品中活菌數的方法是:稀釋塗布平板法。

2. 微生物的培養方法

1.平板劃線分離培養法

對混有多種細菌,採用劃線分離和培養,使原來混雜在一起的細菌沿劃線在瓊脂平板表面分離,得到分散的單個菌落,以獲得純種。平板劃線分離法通常有兩種方法:

①分區劃線分離法:此法常用於含菌量較多的細菌的分離。先用接種環挑取標本塗布於瓊脂平板1區(占培養基總面積的¼)並作數條劃線,再於2、3、4區依次劃線。每劃完一個區域,均將接種環燒灼滅菌1次,冷後再劃下一區域,每一區域的劃線均與上一區域的劃線交接1~3次。一個成功分區劃線的平板,培養後分別觀察1區形成菌苔,2區菌落連成線,3區和4區可分離到單個菌落。

②連續劃線分離法:此法常用於含菌量不多的標本或培養物中的細菌分離培養。方法是先將接種物在瓊脂平板上1/5處輕輕塗抹,然後再用接種環或拭子在平板表面曲線連續劃線接種,直至劃滿瓊脂平板表面。

2.瓊脂斜面接種法

主要用於菌落的移種,以獲得純種進行鑒定和保存菌種等。用接種環(針)挑取單個菌落或培養物,從培養基斜面底部向上劃一條直線,然後再從底部沿直線向上曲折連續劃線,直至斜面近頂端處止。生化鑒定培養基斜面接種,用接種針挑取待鑒定細菌的菌落,從斜面中央垂直刺入底部,抽出後在斜面上由下至上曲折劃線接種。

3.穿刺接種法

此法多用於半固體培養基或雙糖鐵、明膠等具有高層的培養基接種,半固體培養基的穿刺接種可用於觀察細菌的動力。接種時用接種針挑取菌落,由培養基中央垂直刺入至距管底0.4cm處,再沿穿刺線退出接種針。雙糖鐵等有高層及斜面之分的培養基,穿刺高層部分,退出接種針後直接劃線接種斜面部分。

4.液體培養基接種法

用於各種液體培養基如肉湯、蛋白腖水、糖發酵管等的接種。用接種環挑取單個菌落,傾斜液體培養管,在液面與管壁交界處研磨接種物(以試管直立後液體淹沒接種物為准)。此接種法應避免接種環與液體過多接觸,更不應在液體中混勻、攪拌,以免形成氣溶膠,造成實驗室污染。

5.傾注平板法

本法主要用於飲水、飲料、牛乳等標本中的細菌計數。取純培養物的稀釋或原標本1ml至無菌培養皿內,再將已融化並冷卻至45~50℃左右的瓊脂培養基15~20ml傾注入該無菌培養皿內,混勻,待凝固後置37℃培養,長出菌落後進行菌落計數,以求出每毫升標本中所含菌數。先數6個方格(每格為1cm2)中菌落數,求出每格的平均菌落數,並算出平皿直徑,然後按下列公式計數,求出每毫升標本中的細菌數。

全平板菌落數=每方格的平均菌落數×лr2

每ml標本中的細菌數=全平板菌落數×稀釋倍數

6.塗布接種法

本法多用於紙片擴散法葯敏試驗的細菌接種。將一定量或適量的菌液加到瓊脂培養基表面,然後用滅菌的L型玻璃棒或棉拭子於不同的角度反復塗布,使被接種液均勻分布於瓊脂表面,然後貼上葯敏紙片,或直接培養,本法經培養後細菌形成菌苔。

3. 如何培養微生物

液體接種
從中海生物技術固體培養基中將菌洗下,倒入液體培養基中,或者從液體培養物中,用移液管將菌液接至液體培養基中,或從液體培養物中將菌液移至固體培養基中,都可稱為液體接種
穿刺接種
在保藏厭氧菌種或研究微生物的動力時常採用此法。做穿刺接種時,用的接種工具是接種針。用的培養基一般是半固體培養基。它的做法是:用接種針蘸取少量的菌種,沿半固體培養基中心向管底作直線穿刺,如某細菌具有鞭毛而能運動,則在穿刺線周圍能夠生長
活體接種
活體接種是專門用於培養病毒或其它病原微生物的一種方法,因為病毒必須接種於活的生物體內才能生長繁殖。所用的活體可以是整個動物;也可以是某個離體活組織,例如猴腎等;也可以是發育的雞胚。接種的方式是注射,也可以是拌料喂養
澆混接種
該法是將待接的微生物先放入中海生物的培養皿中,然後再倒入冷卻至45°C左右的固體培養基,迅速輕輕搖勻,這樣菌液就達到稀釋的目的。待平板凝固之後,置合適溫度下培養,就可長出單個的微生物菌落
劃線接種
這是最常用的接種方法。即在固體培養基表面作來回直線形的移動,就可達到接種的作用。常用的接種工具有接種環,接種針等。在斜面接種和平板劃線中就常用此法
塗布接種
與澆混接種略有不同,就是先倒好平板,讓其凝固,然後再將菌液倒入平板上面,迅速用塗布棒在表面作來回左右的塗布,讓菌液均勻分布,就可長出單個的微生物的菌落

4. 我想問一下菌種是怎樣培養的

在自然界里,食用菌都不是單獨存在的,而是和許多細菌、放射菌、黴菌等生活在一起的。所謂菌種分離,就是把這些和食用菌一起生活的雜菌分離出來,通過培養,獲得純的優良菌種。菌種分母種、原種、栽培種。
(一)母種的分離培養

食用菌母種的分離,可分為孢子分離法、組織分離法以及基內菌絲分離等。
1.孢子分離法
孢子分離法,是用食用菌的有性孢子或無性孢子萌發成菌絲,培養成菌種的方法。這種菌種生活力較強,但孢子個體之間有差異,且自然分化現象較嚴重,變異大,需經出菇試驗才能在生產上應用。
(l)單孢分離法:是每次或每支試管只取一個擔孢子, 讓它萌發成菌絲體來獲得純菌種的方法。蘑菇和草菇用單孢分離得到的菌絲,有結實能力,可採用此法分離生產純菌種。單孢分離生產上較少採用,而且技術復雜,一般採用多孢分離法。
(2)多孢分離法:就是把許多孢子接種在同一培養基上,讓它們萌發、自由交配來獲得食用菌純菌種的一種方法。具體操作方法,有以下幾種:
①種菇孢子彈射法:選擇個體健壯、朵形圓正,無病蟲害、出菇均勻、高產穩產,適應性強的八九分成熟的種菇,切去大部分,菌柄用無菌水沖洗數遍後再用已滅菌的紗布或脫脂棉、濾紙吸干表面水分。在接種箱或無菌室內,把種菇的菌褶朝下用鐵絲倒掛在玻璃漏斗下面,漏鬥倒蓋在培養皿上面;上端小孔用棉花塞住。培養皿放在一個鋪有紗布的搪瓷盤上,靜置12~20小時,菌褶上的孢子就會散落在培養皿內。形成一層粉末狀孢子印(平菇極淡紫色,蘑菇、草菇 為褐色,香菇、金針菇孢子印白色)。用接種針沾取少量孢子在試管中的瓊脂外面或培養皿上劃線接種。待孢子萌發,生成菌落時,選孢子萌發早、長勢好的菌落進行試管培養。
還可用孢子採集器收集孢子。方法是選好種菇後,按上述程序,輕輕掀開玻璃鍾罩,將種菇柄朝下插在孢子採收器的鋼絲架上,放在培養皿正中央。隨即蓋好玻璃罩,用紗布將鍾掌周圍塞好。並在紗布上倒少許升汞或無菌水。移入 20℃左右恆溫箱培養。
②褶上塗抹法:按無菌操作分離時;應選擇成熟的種菇,用接種針直接插入褶片之間,輕輕抹取褶片表面子實體尚未彈射的孢子,再在培養基上劃線接種。
③鉤懸法:取成熟菌蓋的幾片菌褶或一小塊耳片(黑木耳、毛木耳、白木耳〕,用無菌不銹鋼絲(或鐵絲、棉線等其他懸掛材料)懸掛於三角瓶內的培養基的上方,勿使接觸到培養基或四周瓶壁。置適宜溫度下培養、轉接即可。
④貼附法:按無菌操作將成熟的菌褶或耳片取一小塊, 用溶化的瓊脂培養基或阿拉伯膠、漿糊等貼附在配管斜面培養基正上方的試管壁上。經6~12小時的培養,待孢子落在斜面上,立即把孢子連同部分瓊脂培養基移植到新的試管中培養即可。
孢子分離得到的母種、必須進一步提純復壯,當母種定植一星期左右,菌絲布滿斜面時,選擇菌絲健壯、生長旺盛無老化、無感染雜茵的母種試管,進而轉管擴大,一般到栽培種,轉管不宜超過5次。
孢子分離得到的母種,必須通過出菇試驗,鑒定為優質菌種後,才可供生產使用。
一般菌類如蘑菇、平菇、鳳尾菇、香菇、冬菇和草菇等,都可用多孢分離法獲得母種。
現就銀耳孢子分離略述於下:
按無菌操作獲取種耳後,懸掛種耳的三角瓶經12小時培養後,瓶底培養基表面就有"孢子印"。取出種耳,置 20℃—25℃溫箱培養2~3天,培養基表面會出現乳白色透明的糊狀小菌落,就是銀耳的酵母狀分生孢子形成的少量銀耳菌絲。此時移接入試管斜面培養基上,待長滿斜面後,再移接入營養豐富,且表面比較乾燥的培養基上。經30天左右,菌落長出白色菌絲。
銀耳的酵母狀分生孢子、菌絲只有與羽毛狀菌絲的子囊菌(香灰菌絲)混合培養時,由後者幫助分解木材及其他一些纖維物質,提供營養,才能利於銀耳孢子萌發,菌絲的定植和子實體的形成。
在兩種菌絲交會時,先選出兩種純菌絲。
羽毛狀菌絲要純化選育,一般要選取生長迅速,爬壁力強的試管斜面或種瓶,取先端菌絲,轉管移接,置25℃—28℃上培養,重復轉管幾次即可得到優良純種。
銀耳菌絲的特點,菌絲生長緩慢,擔孢子也不易萌發。在進行兩菌混合時,先取經8~IO天培養的銀耳菌絲斜面,按無菌操作方法在該斜面上距銀耳菌絲約0.5厘米處接入一 小塊羽毛狀菌絲。置25℃下培養1周即得到混合好的銀耳母種。
2.組織分離培養法
利用子實體內部組織,進行無性繁殖而獲得母種的簡便方法,即組織分離。該法操作簡便,菌絲生長發育快,品種特性易保存下來,特別是雜交育種後,優良菌株用組織分離法能使遺傳特性穩定下來。常採用以下分離方法。
(l)子實體分離:種菇要選朵大蓋厚,柄短,八九分成熟的優良品種。切去菇兩基部,在無菌箱內以0.1%的升汞水浸幾分鍾,再用無菌水沖洗並揩乾或用75%酒精棉球擦拭菌蓋與菌柄2次,進行表面消毒。接種時,只要將種菇撕開,在萌蓋和菌柄交界處或菌褶處,挑取一小塊組織;移接 到PDA培養基上。置25℃左右溫度下培養3-5天,就可以看到組織上產生白色絨毛狀菌絲,轉管擴大即得到菌種。如香菇、平菇等可以用此方法。
(2)菌核分離:茯苓、豬苓、雷丸等菌的子實體不易採集。而常見的是它貯藏營養的菌核。用菌核分離,同樣可以獲得菌種。方法是將菌核表面洗凈,用酒精或升汞消毒後,切開菌核,取中間組織一小塊,約黃豆大小,接種在PDA 培養基斜面上,保溫培養。應注意的是,菌核是貯藏器官,大部分是多糖類物質,只含有少量的菌絲,因此挑取的組織塊要大一些,如果組織塊過小,則不易分出菌種。
(3)菌素分離:有一部分子實體不易找到,也沒有菌核,可以用菌素進行分離。如蜜環菌、假蜜環菌。其操作方法是先用酒精或升汞將菌素表面黑色皮層輕輕擦拭2~3次, 然後去掉黑色外皮層(菌鞘),抽出白色菌髓部分;用無菌剪刀將菌髓剪一小段,接種在培養基上,保溫培養,即得該菌菌種。
菌素分離要注意:因菌素比較細小,分離素也比較細小,分離時極易污染雜菌,所以要嚴格操作。
3.基內菌絲分離培養法
利用食用菌生育的基質作為分離材料,來得到純菌種的一種方法,叫基內菌絲分離法。
此種分離方法是適宜只有在特定的季節才出現,而且是朝生暮死,不易採得的子實體。基內分離法與組織分離法不同之點是,乾燥的菇木或耳木中的菌絲常呈休眠狀態。接種後有時並不立刻恢復生長。因此,有必要保留較長的時間(約1個月),以斷定菌絲是否能成活。基內菌絲分離法又可分為,材中菌絲分離(即菇木或耳木分離法)及土中菌絲分離法等。
(1)材中菌絲分離法:就是菇木或耳木分離法,為了減少雜菌的感染,菇(耳)木在分離之前,必須進行無菌處理。可以把菇(耳)水表面用酒精燈火焰輕輕燒過,以燒死黴菌的孢子,或再用0.1%的升汞水浸孢幾分鍾,然後用無菌水沖洗後用無菌濾紙吸干。接種塊切取時應注意。接種塊必須在該菌菌絲分布的范圍內切取。所以,菌絲生長緩慢的種類應淺取;菌種生長快的種類可以深取。同時。還應根據菇菌的種類、木材質地、菇(耳)木粗細、發育時間的長短來確定菌絲分布的范圍。然後用一把利刀進行切取。接種塊應盡量小些,以減少雜菌感染機會,提離菌種的純度。接種塊移到培養基上,就應該放到適合菌絲生長的22℃~26℃ 的溫室或溫箱中培養,使菌絲恢復生長。
(2)土中菌絲分離:食用菌種類很多,許多土生的食用菌;孢子不易萌發。組織分離也不易成功,用土中菌絲分離獲得純種的方法,叫土中菌絲分離。
土中菌絲分離時要注意,由於土中菌絲體的周圍生活著多種多樣的土壤微生物,因此分離時必須盡可能避開這些微生物的干擾,盡可能批取清潔菌絲素的尖端、不帶雜物的菌絲接種,反復用無菌水沖洗,在培養基中加入一些抑制細菌 生長的葯物,如 40微克/升的鏈黴素或金黴素。如發現感染細菌,可以把菌落邊緣的菌絲挑出來,接種到木屑培養基中。因細菌沒有分解木質素的能力,因此在木屑培養基中不易擴展;只局限於接種處。待菌絲長出感染區後,就可以再進行擴大提純了。
(3)子實體基部分離:從瓶栽、袋栽或大床栽培的子實體基部分離出新菌絲的方法,叫子實體基部分離,現以袋栽銀耳為例說明:
從出耳早、出耳率離、無病蟲害的栽培室中;選擇生活力最強的幼耳5袋,移到氣候溫和,有散射光的野外場所進行後期培養,以增強菌絲體的生活力。經培養7~10天後,待子實體直徑達4~5厘米時便可取回,作為分離的母體。再從中篩選最理想的一朵,用利刀割掉銀耳子實體,放置於 0℃的冰箱或有敵敵畏的容器中過夜,以便殺死瓶中的害蟲。然後用75%酒精或升汞擦洗耳基和袋子外邊的雜質,連同接種工具、接種培養基等移進無菌室。經滅菌後,用接種刀把袋口上部約15毫米厚的老菌根挖除,並進行培養。待袋口露出白色菌絲時,用接種針挑取一塊半粒米大的白色菌結體,迅速移入母種試管培養基的中央,輕輕地脫去接種針, 塞上棉塞。 為了能夠獲得較多的母種,一次接種量要有100—200支試管,以便從中選擇。分離後應及時移入22℃—24℃恆溫箱或溫室中培養。由於培養基內水分較多,菌絲恢復要比耳木分離得快。經2-3天後,分離物的邊緣就可看 到白色菌絲。每天要至少觀察兩次,以便提純。觀察、提純方法與耳木分離法擔同。經適溫培養10-15天後,當接種塊扭結團出現紅、黃色水珠時,即可擴大原種。

(二)原種和栽培種的接種培養

母種獲得以後,為了滿足菌種生產的需要。應選出優良、純度高的母種進一步擴大為原種。
原種培養基一般採用棉籽殼、木屑、草類等培養基。
瓶裝或袋裝的原種培養基滅菌後,可送入滅過菌的接種箱內,待瓶中的培養基冷至30℃以下,可按照無菌操作程序進行接種。
菌種瓶(袋)放入培養室時,要經常進行檢查,一經發現雜菌污染,立即取出。培養成的原種,菌絲體必須健壯有力,緊貼瓶壁而不幹縮,顏色純正,具有一定清香味,生活力強,擴製成栽培種時吃料快。
栽培種就是將原種進一步擴大培養成三級種,它和原種的接種及培養相同。一般香菇、平菇、冬菇、猴頭、木耳、銀耳的栽培種多用鋸木、棉皮作培養基。蘑菇多用糞草做培養料。
栽培種要求料塊不脫水干縮。菌絲體健壯有力、顏色純正,有清香味,無老化現象,無雜菌污染,有的種許可有少量原基,接入栽培料後,發菌快,長勢好,生活力強。
原種在接栽培種時,原種瓶口的一層菌絲體應挖去不用。

(三)液體種的簡單培養

目前,用液體深層發酵法生產菌種,具有生產量大、周期短、菌齡整齊、成本低廉、接種方便等特點,是實現食用菌工廠化生產的目標。現將液體種培育過程簡述於後,供參考。
簡言之就是將純正優良的菌種,接入液體培養基(固體培養基不加凝固劑),使菌絲繁殖形成大量小菌球,然後將這種培養基拌入木屑或棉籽皮料內,製成菌塊、培養其形成子實體。還可用於制原種、栽培種。
培養液體菌種,可將培養液裝入三角瓶中,約占空瓶的五分之一重量。用搖瓶機(也稱搖床)來培養。搖瓶機有旋轉式和往復式兩種,一般多用往復式。液體培養基可用馬鈴薯汁(加糖),麥芽汁配製,也可用玉米粉、豆餅粉、糖、無機鹽等配製。可以混合培養基,因適用於多種食用菌和葯用菌的培養,均有好效果。組分:豆餅粉2%,玉米粉1%, 葡萄糖3%,酵母粉0.5%,磷酸二氫鉀0.1%,碳酸鈣 0.2%, pH自然, 12℃滅菌半小時。然後接種培養。
如果生產量較大,在三角瓶的基礎上,再逐級擴大種子缸,發酵罐中進行液體深層通氣發酵,產生大量菌種。但由於生產中要求設備繁多,技術性強,我們還應創造條件;實現食用菌栽培的現代化。

(四)菌種質量的鑒定

菌種質量鑒定最好的方法是,做出菇試驗。但是時間比較長。在購置菌種時,或在菌種生產中,如何能知菌絲生長情況,快速判斷菌種質量?我們介紹幾種方法:
1.肉眼觀察:優良菌種菌絲濃白,絨狀,粗壯密集,生長整齊,速度快,香味濃厚。
2.優良菌種標准可歸納為:"純、香、正、壯、潤"五個字。檢查時,打開瓶塞,從菌種瓶中部取出小塊菌絲體,觀察色澤,聞其氣味,手捏料塊檢查其含水量,看是否符合上述要求標准。
3.顯微鏡檢查:挑取少量菌絲,置顯微鏡上觀察其形態,菌絲分枝,分隔情況,鎖狀聯合,細胞膜的厚薄。 培養觀察:從菌種瓶中挑取小塊菌絲體,接種斜面試管培養基上,置23℃~25℃恆溫中培養,經五周後檢查菌種生活力。如果菌絲生長快,旺盛純一,健壯濃厚,長且整齊,則表示菌種的生活力強。
4.分塊法:在桌上放一張白紙,把菌齡相同的菌種從瓶內取出一大塊,用手分成2塊,再把2塊分成4塊,4塊 分成8塊,依次進行。優良菌種整塊多,碎渣少。劣次菌整塊少,碎渣多。
5.液體菌種鑒別:當三角瓶或發酵缸培養3-7天後,如液面出現氣泡,產生"油皮"、混濁等現象,說明菌種本 身帶有雜菌。如菌塊上浮,或遲遲長出很薄的菌絲層,則說明菌種生活力弱。白塊四周的菌絲生長快、濃白、棉絮狀,表明菌種生命力強。

(五)菌種生產過程中的雜茵防治

在生產菌種時,要時刻注意雜菌污染,以防為主,一旦發生,根治很不容易。所以整個制種過程都必須在無菌條件下進行。接種箱及所有分離、接種的用具、器皿,都要進行嚴格的消毒滅菌。工作人員的雙手要用消毒劑清洗,並穿戴消過毒的工作服、帽和口罩,動作要敏捷、准確,盡量不要講話走動,以防空氣中的雜菌感染。
分離母種時,選擇出菇早、生活力強,第一潮菇是關鍵,因它生活力強,接種後迅速佔領陣地,無雜菌侵入的機會。
被污染的菌種,原因是多方面的,一般是滅菌不徹底所致,或因接種時無菌操作不嚴、瓶蓋不合適造成的。所以滅菌一定要徹底,最好在接種萌將培養基置25℃左右溫箱中做效果檢查,經2天不長雜菌,說明徹底,可以使用,接種過程中一定要嚴格無菌操作。
污染雜菌另一個原因可能是分離母種時感染雜菌,因種菇表面帶菌,消毒不徹底,通過組織塊將雜菌帶入培養基。
總之,污染機會很多,要注意環境消毒,按無菌操作規程徹底滅菌,層層把關,環環抓緊,嚴加註意;提離菌種質量。

5. 微生物培養方法

微生物培養法是在人為條件下繁殖微生物的方法。根據微生物的種類以及對養料、溫度、氧氣、水分、酸鹼度等環境條件的要求不同,並聯系生產和實驗上的具體要求,可有不同的培養方法。可分好氣培養法和厭氣培養法兩類。中海生物技術的培養基一是好氣微生物培養法,常用:①搖床培養法,即將微生物接種於盛有液體培養基的三角瓶後,放在恆溫培養室中的搖床上作有節奏的振盪,使空氣不斷進入培養液中,促其良好生長;②淺盤培養法,又稱表面培養法,在盤內放一淺層培養基,使微生物能夠充分接觸空氣,而有利於生長繁殖,但此法所需空間大,並且容易污染雜菌;③深層培養法,適用於好氣微生物的大規模發酵培養,在大容積的液體培養基中,通入無菌空氣,並不斷攪拌,可使微生物充分接觸空氣,迅速繁殖並積累代謝產物。二是厭氣微生物培養法,實驗室常用化學還原劑或抽氣機吸除培養基中的分子氧,也有用靜止狀態的深層培養法。在生產中常用密封式發酵罐或不通風的固體發酵法。

6. 急求微生物細菌的培養方式

1.固體培養法:對好氧菌,有試管斜面法、培養皿瓊脂平板法等平板培養法;對厭氧菌,有高層瓊脂柱和厭氧培養皿等。
2.液體培養法:試管液態培養;三角瓶淺層液體培養;搖瓶培養(即振盪培養)
希望對你有用!

7. 如何培養微生物

實驗一 常用培養基的制備、滅菌與消毒
實驗二 土壤中微生物分離純化培養
實驗三 菌種保藏
實驗四 細菌形態觀察及單染色
實驗五 放線菌及黴菌形態觀察
實驗六 革蘭氏染色及芽孢染色
實驗七 酵母菌的形態觀察及死活細胞的鑒定
實驗八 微生物直接計數法及測微技術
實驗九 大腸桿菌生長曲線的測定
實驗十 水中細菌總數的測定
實驗十一細菌細胞的生化反應實驗
實驗十二噬菌體的分離、純化及效價測定

實驗一 常用培養基的制備、滅菌與消毒

一、實驗目的
了解培養基的配製原理;掌握配製培養基的一般方法和步驟;了解常見滅菌、清毒基本原理及方法;掌握乾熱天菌、高壓蒸汽滅菌及過濾除菌的操作方法。

二、實驗原理
培養基是人工按一定比例配製的供微生物生長繁殖和合成代謝產物所需要的營養物質的混合物。培養基的原材料可分為碳源、氮源、無機鹽、生長因素和水。根據微生物的種類和實驗目的不同,培養基也有不同的種類和配製方法。
牛肉膏蛋白腖培養基是一種應用最廣泛和最普通的細菌基礎培養基,有時又稱為普通培養基。由於這種培養基中含有一般細胞生長繁殖所需要的最基本的營養物質,所以可供微生物生長繁殖之用。
乾熱天菌、高壓蒸汽滅菌方法主要是通過升溫使蛋白質變性從而達到殺死微生物的效果。

三、試劑與器材
1.器材 試管、三角瓶、燒杯、量筒、玻璃棒、培養基、分裝器、天平、牛角匙、高壓蒸汽滅菌鍋、pH度紙、棉花、牛皮紙、記號筆、麻繩、紗布、吸管、培養皿、電烘箱、注射器、微孔濾膜過濾器、鑷子等。
2.試劑 牛肉膏、蛋白腖、NaCl、瓊脂

四、實驗內容
1.稱量→溶化→調pH→過濾→分裝→加塞→包紮→滅菌→無菌檢查
2.乾熱滅菌:裝入待滅菌物品→升溫→恆溫→降溫→開箱取物
3.高壓蒸汽滅菌:加水→裝物品→加蓋→加熱→排冷空氣→加壓→恆壓→降壓回零→排汽→取物→無菌檢查
4.過濾除菌:組裝滅菌→連接→壓濾→無菌檢查→清洗滅菌
五、關鍵步驟及注意事項
1.要嚴格按配方配製。
2.調pH不要過頭。
3.乾熱滅菌要注意物品不要堆放過緊,注意溫度的時間控制,70ºC以下放物、取物。
4.高壓滅菌要注意物品不要過多,加熱後排除冷空氣,到時降壓回零取物。
5.過濾除菌要注意各部件滅菌,壓濾時,壓力要適當,不可太猛太快,濾膜要注意清洗保存。

實驗二 土壤中微生物分離純化培養

一、實驗目的
掌握倒平板的方法和幾種常用的分離純化微生物的基本操作技術;了解不同的微生物菌落在斜面上、半固體培養基和液體培養基中的生長特徵;進一步熟練和掌握微生物無菌操作技術;掌握微生物培養方法。

二、實驗原理
從混雜的微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過程稱為微生物的分離與純化。常用的分離、純化方法:單細胞挑取法,稀釋塗布平板法,稀釋混合平板法,平板劃線法 稀釋塗布平板法步驟:倒平板-制備土壤污水稀釋液-塗布-培養-挑菌落;平板劃線法步驟:倒平板-標記培養基名稱-劃線。
三、試劑與器材
1.器材 盛9m1無菌水的試管、盛90m1無菌水並帶有玻璃珠的三角燒瓶、無菌玻璃塗棒、無菌吸管、接種環、酒精燈、無菌培養皿、顯微鏡、血細胞計數板等。
2.試劑 牛肉膏蛋白腖培養基,高氏1號培養基,查氏培養基

四、實驗內容
1.土壤稀釋液的制備
2.微生物分離純化:稀釋塗平板法,平皿劃線分離法,微生物培養技術

五、關鍵步驟及注意事項
1.掌握含菌培養基的配製,嚴格控制溫度。
2.平板劃線應防止染菌,同時應注意劃線深度及密度。
實驗三 菌種保藏
一、實驗目的
1.學習並掌握菌種保藏的基本原理。
2.掌握常用的幾種不同的菌種保藏方法。

二、實驗原理
微生物個體微小、代謝旺盛、生長繁殖快,如果保存不妥容易發生變異和雜菌污染,甚至導致細胞死亡等現象。因此,保存好菌種是非常必要和重要的。常用的菌種保藏方法包括傳代培養法、載體法、懸液法、冷凍法和真空乾燥法

三、試劑與器材
1.材料 大腸桿菌、青黴菌、放線菌
2.試劑 液體石蠟、甘油、五氧化二磷、95%乙醇、10%鹽酸、無水氯化鈣、食鹽、乾冰
3.器材 無菌吸管、無菌滴管、無菌培養皿;安額管、凍干管、40目與100目篩子、油紙、濾紙條(0.5X1.2cm)、乾燥器、真泵器、真空泵、真空壓力表、噴燈、L形五通管、冰箱、低溫冰箱(—30℃)、超低溫冰箱和液氮罐等。

四、實驗內容
1.斜面保藏法
2.液體石蠟法
3.穿刺保藏法
4.砂土管保藏法
5.冷凍真空乾燥保存法

五、關鍵步驟及注意事項
1.清楚各種保藏方法的優缺點,針對不同要求選擇適宜的保藏方法。
2.熔封安瓶時防止封閉不嚴。
3.液氮凍存操作應防止凍傷。

實驗四 細菌形態觀察及單染色

一、實驗目的
1.了解簡單染色法的原理,並掌握其操作方法。
2.學習並掌握微生物塗片、染色的基本技術和無菌操作技術。
3.鞏固顯微鏡(油鏡)的使用方法。
4.初步認識細菌的形態特徵。

二、實驗原理
細菌個體微小,且較透明,必須藉助染色法使菌體著色,與背景形成鮮明的對比,以便在顯微鏡下進行觀察。根據實驗目的不同,可分為簡單染色法、鑒別染色法和特殊染色法等。簡單染色法是最基本的染色方法,是利用單一染料對細菌進行染色。此法操作簡便,適用於菌體一般形狀和細菌排列的觀察。常用鹼性染料進行簡單染色。

三、試劑與器材
1.材料 大腸桿菌,枯草芽孢桿菌
2.試劑 呂氏鹼性美藍染液(或草酸銨結晶紫染液)、齊氏石炭酸復紅染液。
3.器材 顯微鏡、酒精燈、載玻片、接種環、雙層瓶(內裝香柏油和二甲苯)等。

四、實驗內容
簡單染色法:塗片→乾燥→固定→染色→水洗→乾燥→鏡檢

五、關鍵步驟及注意事項
1.塗片時,生理鹽水及取菌不宜過多,塗片應盡可能均勻,
2.水洗步驟水流不宜過大,過急,以免塗片薄膜脫落。

實驗五 放線菌及黴菌形態觀察

一、實驗目的
1.了解放線菌、黴菌形態觀察的原理。
2.學習並掌握觀察放線菌、黴菌形態的操作方法。
3.初步了解放線菌、黴菌的形態特徵。

二、實驗原理
放線菌是指能形成分枝絲狀體或菌絲體的一類革蘭氏陽性細菌。常見放線菌大多能形成菌絲體,緊貼培養基表面或深入培養基內生長的叫基內菌絲(簡稱「基絲」),基絲生長到一定階段還能向空氣中生長出氣生菌絲(簡稱「氣絲」),並進一步分化產生孢子絲及孢子。有的放線菌只產生基絲而無氣絲。在顯微鏡下直接觀察時,氣絲在上層、基絲在下層,氣絲色暗,基絲較透明。孢子絲依種類的不同,有直、波曲、各種螺旋形或輪生。
黴菌可產生復合分枝的菌絲體,分基內菌絲和氣生菌絲,氣生菌絲生長到一定階段分化產生繁殖菌絲,由繁殖菌絲產生孢子。黴菌菌絲體(尤其是繁殖菌絲)及孢子的形態特徵是識別不同種類黴菌的重要依據。黴菌菌絲和孢子的寬度通常比細菌和放線菌粗得多,常是細菌菌體寬度的幾倍至幾十倍,因此,用低倍顯微鏡即可觀察。人們設計了各種培養和觀察方法,這些方法的主要目的是為了盡可能保持放線菌自然生長狀態下的形態特徵。本實驗採用插片法。
插片法:將放線菌接種在瓊脂平板上,插上滅菌蓋玻片後培養,使放線菌菌絲沿著培養基表面與蓋玻片的交接處生長而附著在蓋玻上。觀察時,輕輕取出蓋玻片,置於載玻片上直接鏡檢。這種方法可觀察到放線菌自然生長狀態下的特徵,而且便於觀察不同生長期的形態。

三、試劑與器材
1.材料 黑麴黴、青黴和根霉,細黃鏈黴菌或青色鏈黴菌,滅菌的高氏I號瓊脂和滅菌的查氏培養基。
2.實驗器材 經滅菌的:平皿、玻璃紙、無菌吸管、蓋玻片、玻璃塗棒,以及載玻片、接種環、接種鏟、鑷子、顯微鏡等。

四、實驗內容
倒平板→接種→插片→培養→鏡檢

五、關鍵步驟及注意事項
1.倒平板要厚一些,接種時劃線要密。
2.插片時要有一定角度並與劃線垂直。
3.觀察時,宜用略暗光線;先用低倍鏡找到適當視野,更換高倍鏡觀察。
4.如果用0.1%美藍對培養後的蓋玻片進行染色後觀察,效果會更好。
實驗六 革蘭氏染色及芽孢染色
一、實驗目的
1.了解革蘭氏染色法和芽孢染色法的原理,並掌握其操作方法。
2.了解革蘭氏染色法在細菌分類鑒定中的重要性。
3.學習並掌握微生物塗片、染色的基本技術和無菌操作技術。
4.學習顯微鏡(油鏡)的使用方法。
5.初步認識細菌的形態特徵。

二、實驗原理
革蘭氏染色法的基本步驟是:先用初染劑結晶紫進行染色,再用碘液媒染,然後用乙醇(或丙酮)脫色,最後用復染劑(如番紅)復染。經此方法染色後,細胞保留初染劑藍紫色的細菌為革蘭氏陽性菌;如果細胞中初染劑被脫色劑洗脫而使細菌染上復染劑的顏色(紅色),該菌屬於革蘭氏陰性菌。革蘭氏染色反應是細菌重要的鑒別特徵,為保證染色結果的正確性,採用規范的染色方法是十分必要的。
芽孢染色法的基本原理,用著色力強的染色劑孔雀綠或石炭酸復紅,在加熱條件下染色,使染料不僅進入菌體也可進入芽孢內,進入菌體的染料經水洗後被脫色,而芽孢一經著色難以被水洗脫,當用對比度大的復染劑染色後,芽孢仍保留初染劑的顏色,而菌體和芽孢囊被染成復染劑的顏色,使芽孢和菌體更易於區分。

三、試劑與器材
1.材料:枯草芽孢桿菌12~18h營養瓊脂斜面培養物,大腸桿菌約24h營養瓊脂斜面培養物
2.試劑 革蘭氏染色液(結晶紫液、碘液、95%乙醇、番紅液)。5%孔雀綠水溶液
3.實驗器材 小試管、滴管、燒杯、試管架、濾紙、木夾子、載玻片、蓋玻片、凹載玻片、無菌水、顯微鏡等、接種環、雙層瓶(內裝香柏油和二甲苯)、擦鏡紙、生理鹽水等。

四、實驗內容
1.革蘭氏染色法 製片→初染→媒染→脫色→復染→鏡檢。
2.Schaefer-Fulton氏染色法 製片→染色→水洗→復染→水洗→鏡檢。

五、關鍵步驟及注意事項
1.塗片時,生理鹽水及取菌不宜過多,塗片應盡可能均勻,
2.乙醇脫色是革蘭氏染色操作的關鍵環節,嚴格掌握脫色時間。

實驗七 酵母菌的形態觀察及死活細胞的鑒定

一、實驗目的
1.觀察酵母菌的形態特徵、出芽生殖方式,並掌握酵母菌與細菌形態特徵的區別。
2.學習鑒別死活細胞的實驗方法。

二、實驗原理
酵母菌是單細胞的真核微生物,菌體比細菌大而且不運動。酵母菌的繁殖方式分為無性繁殖和有性繁殖兩種,以無性繁殖為主。芽殖是酵母菌普遍的無性繁殖方式,少數為裂殖;有性繁殖是產生子囊和子囊孢子。本實驗是通過美藍染液水浸片和水一碘液水浸片來觀察酵母的形態和芽殖方式。
美藍是一種無毒性的染料,它的氧化型呈藍色,還原型無色。用美藍對酵母活細胞染色時,由於細胞的新陳代謝作用,細胞內具有較強的還原能力,能使美藍由藍色的氧化型變為無色的還原型,而對代謝作用微弱或死細胞,無此還原能力或還原能力極弱,而被美藍染成藍色或淡藍色。因此,不僅用此法可觀察酵母細胞形態,也可用來鑒別酵母菌的死細胞和活細胞。

三、試劑與器材
1.材料 釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或卡爾酵母(Saccharomyces calsbergensis)培養2天左右的麥芽汁(或豆芽汁)液體培養物。
2.試劑 0.05%和O.1%呂氏鹼性美藍染色液、革蘭氏染色用的碘液。
3.器材 顯微鏡、載玻片、蓋玻片、接種環、灑精燈等。

四、實驗內容
1.美藍浸片觀察 酵母培養→製片→染色→鏡檢→30分鍾後再鏡檢
2.水-碘浸片觀察

五、關鍵步驟及注意事項
1.染液不宜過多或過少,否則,在蓋上蓋玻片時,菌液溢出或出現大量氣泡。
2.用鑷子取一塊蓋玻片,先將一側與菌液接觸,然後慢慢將蓋玻片放下,使其蓋在菌液上,蓋玻片不宜平著放下,避免氣泡產生。

實驗八 微生物直接計數法及測微技術

一、實驗目的
1.了解血球計數板計數原理,並掌握計數方法。
2.掌握用測微尺測定微生物大小的方法。

二、實驗原理
顯微鏡直接計數法是將一定稀釋的菌體或孢子懸液注入血球計數板的計數室中,於顯微鏡下直接計數的一種簡便、快速、直觀的方法。因為計數板是一塊特別的載玻片。其上由四條槽構成三個平台;中間較寬的平台又被一短橫槽隔成兩半,每一邊的平台上各刻有一個方格網,每個方格網共分為九個大方格,一種是一個大方格分成25個中方格,而每個中方格又分成16個小方格(見圖2—3—44);另一種是一個大方格分成16個中方格,每個中方格又分成25個小方格,無論哪種每個大方格中的小方格都是400個。每一個大方格邊長為0.1mm,所以計數室的容積為0.1mm3。計數時,通常只用5個中格內的菌體(孢子)數即可。然後求出每個中方格的平均值,再乘上25或16,得出一個大方格中的總茵數,再換算成lml菌液中的總菌數。若設5個中方格中總菌數為N,菌液稀釋倍數為M,如果是25個中方格計數板,則計算方法為:
lml菌液中的總菌數=平均每個中格中菌的個數×25×104×M=50000N·M(個)
微生物細胞的大小是微生物基本的形態特徵,也是分類鑒定的依據之一。微生物大小的測定,需要在顯微鏡下,藉助於特殊的測量工具——測微尺,包括目鏡測微尺和鏡台測微尺。鏡台測微尺是中央部分刻有精確等分線的載玻片,一般是將1mm等分為100格,每格長0.01mm(即10pm)。鏡台測微尺並不直接用來測量細胞的大小,而是用於校正目鏡測微尺每格的相對長度。
三、試劑與器材
1.材料 釀酒酵母、藤黃微球菌和大腸桿菌的染色標本片、釀酒酵母24h馬鈴薯斜面培養物。
2.實驗器材 細胞計數板、顯微鏡、蓋玻片、無菌毛細滴管、目鏡測微尺、鏡台測微尺、載玻片、蓋玻片、顯微鏡等。

四、實驗內容
1.微生物直接計數法 菌懸液制備→鏡檢計數室→加樣品→顯微鏡計數→清洗血細胞計數板
2.微生物測微技術 裝目鏡測微尺→校正→菌體大小測定

五、關鍵步驟及注意事項
1.防止加樣空氣泡產生。
2.調節顯微鏡光線的強弱適當。
實驗九 大腸桿菌生長曲線的測定

一、實驗目的
1.了解大腸桿菌的生長曲線特徵和繁殖規律,並學會繪制生長曲線。
2.復習光電比濁法測量細菌數量的方法。

二、實驗原理
將一定量的細菌轉入新鮮液體培養基中,在適宜的條件下培養細胞要經歷延遲期、對數期、穩定期和衰亡期四個階段。以培養時間為橫坐標,以細菌數目的對數或生長速率為縱坐標作圖所繪制的曲線稱為該細菌的生長曲線。不同的細菌在相同的培養條件下其生長曲線不同,同樣的細菌在不同的培養條件下所繪制的生長曲線也不相同。

三、試劑與器材
1.材料與試劑 大腸桿菌、LB液體培養基70ml、分裝2支大試管(5ml/支)、剩餘60ml裝入250ml的三角瓶。
2.器材 722型分光光度計、恆溫振盪搖床、無菌試管、無菌吸管等。

四、實驗內容
編號→接種→培養→比濁測定

五、關鍵步驟及注意事項
1.測定OD值時,要求從低濃度到高濃度測定
2.嚴格控制培養時間

實驗十 水中細菌總數的測定

一、實驗目的
1.學習水樣的採取方法和水樣細菌總數測定的方法。
2.了解水源水的平板菌落計數的原理。

二、實驗原理
本實驗應用平板計數技術測定水中細菌總數。由於水中細菌種類繁多,它們對營養和其他生長條件的要求差別很大,不可能找到一種培養基在一種條件下,使水中所有的細菌均能生長繁殖,因此,以一定的培養基平板上生長出來的菌落,計算出來的水中細菌總數僅是一種近似值。目前一般是採用普通牛肉膏蛋白腖瓊脂培養基。

三、試劑與器材
1.試劑 牛肉膏蛋白腖瓊脂培養基,滅菌水
2.器材 滅菌三角瓶,滅菌的帶玻璃塞瓶,滅菌培養皿,滅菌吸管,滅菌試管等。

四、實驗內容
1.水樣的採取
2.細菌總數測定
3.菌落計數方法

五、關鍵步驟及注意事項
1.注意全過程防止染菌
實驗十一 細菌細胞的生化反應實驗

一、實驗目的
了解並掌握細菌鑒定中常用生理生化反應的原理和方法。

二、實驗原理
各種細菌由於具有不同的酶系統,致使它們能利用不同的底物,或雖然可以利用相同的底物,卻產生不同的代謝產物,因此可以利用各種生理生化反應來鑒別細菌。
糖發酵是最常用的生化反應,存在於大多數細菌中。不同的細菌在糖的分解能力上存在很大的差異。有些細菌能分解某種糖並產生酸性物質(如乳酸、丙酸、醋酸等)和氣體(如二氧化碳、氫、甲烷等),而有些細菌只產生酸不產生氣體。例如大腸桿菌分解乳糖和葡萄糖產酸並產氣,普通變形桿菌分解葡萄糖產酸產氣,但不能分解乳糖。酸的產生可利用指示劑來判斷。在培養基中加入溴甲酚紫(pH5.2為黃色,pH6.8為紫色),當發酵產酸時,使培養基由紫色變為黃色。氣體的產生可由發酵試管中倒置的德漢氏小管中有無氣泡的出現來驗證.

三、試劑與器材
1.材料大腸桿菌、普通變性桿菌、產氣桿菌、糖發酵培養基、蛋白腖水培養基、葡萄糖蛋白腖水培養基。
2.試劑甲基紅試劑、40%KOH、5%a一萘酚、乙醚、吲哚試劑。
3.實驗器材德漢氏小管、試管、接種環、恆溫培養箱。

四、實驗內容
培養基配製→編號→試管→接種→培養→觀察結果

五、關鍵步驟及注意事項
1.要嚴格按照培養基配方配製培養基。
2.觀察結果時要注意滴加葯量及反應時間。
實驗十二 噬菌體的分離、純化及效價測定

一、實驗目的
1.學習分離、純化噬菌體的原理和方法
2.觀察噬菌斑的形態和大小
3.掌握噬菌體效價測定的基本方法

二、實驗原理
噬菌體是細菌的專性寄生物,自然界中凡是有細菌存在的地方,均可以發現其特異性的噬菌體,噬菌體侵入細菌細胞後,利用宿主細胞的酶系統進行復制和增殖,最終導致細菌細胞裂解,噬菌體從細胞中釋放出來,可以進一步侵染細菌細胞。在液體培養基中,噬菌體可以使渾濁的菌懸液變為澄清。在長有宿主細菌的固體培養基平板上,噬菌體可以裂解細菌形成透明的空斑,即噬菌斑,一個噬菌體產生一個噬菌斑,因此可以利用這個性質對噬菌體進行分離和效價的測定。
噬菌體的效價是指噬菌體的濃度,即一毫升培養液中所含有的噬菌體數量。噬菌體效價的測定方法多採用雙層瓊脂平板法。先在培養皿中倒入底層固體培養基,凝固後再倒入含有宿主細菌和一定稀釋度噬菌體的半固體培養基。培養一段時間後,計算噬菌斑的數量。

三、試劑與器材
1.材料大腸桿菌、牛肉膏蛋白腖固體培養基、牛肉膏蛋白腖半固體培養基(含有瓊脂0.5%,試管分裝,每管3~5m1)、三倍濃縮的牛肉膏蛋白腖液體培養基。
2.器材培養皿、無菌吸管、三角瓶、抽濾瓶、蔡氏細菌濾器、真空泵、陰溝污水。

四、實驗內容
噬菌體分離→噬菌體純化→效價測定

五、關鍵步驟及注意事項
1.噬菌體時要注意細菌濾器的型號。
2.純化噬菌體時要注意形態、大小。
3.效價測定時要注意雙層瓊脂平板法的使用技巧。

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