1. 如何建立色譜含量測定方法
含量測定分析方法驗證
摘要：本文介紹了在對含量測定所用的分析方法進行方法學驗證時，各項指標的可接受標准，以利於判斷該分析方法的可行性。
關鍵詞：含量測定 分析方法驗證 可接收標准
在進行質量研究的過程中，一項重要的工作就是要對質量標准中所涉及到的分析方法進行方法學驗證，以保證所用的分析方法確實能夠用於在研葯品的質量控制。為規范對各種分析方法的驗證要求，我國已於2005年頒布了分析方法驗證的指導原則。該指導原則對需要驗證的分析方法及驗證的具體指標做了比較詳細的闡述。但是文中未涉及各具體指標在驗證時的可接受標准，國際上已頒布的指導原則中也未發現相關的要求。另一方面，大多數葯品研發單位在進行質量研究時，已逐步認識到分析方法驗證的必要性與重要性，大都也在按照指導原則的要求進行分析方法驗證，但驗證完後卻因沒有一個明確的可接受標准，而難以判斷該分析方法是否符合要求。本文結合國外一些大型葯品研發企業在此方面的要求，提出了在對含量測定方法進行驗證時的可接受標准，供國內的葯品研發單位在進行研究時參考。
1.准確度
該指標主要是通過回收率來反映。驗證時一般要求分別配製濃度為80%、100%和120%的供試品溶液各三份，分別測定其含量，將實測值與理論值比較，計算回收率。
可接受的標准為：各濃度下的平均回收率均應在98.0%-102.0%之間，9個回收率數據的相對標准差(RSD)應不大於2.0%。
2.線性
線性一般通過線性回歸方程的形式來表示。具體的驗證方法為：
在80%至120%的濃度范圍內配製6份濃度不同的供試液，分別測定其主峰的面積，計算相應的含量。以含量為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)，進行線性回歸分析。
可接受的標准為：回歸線的相關系數(R)不得小於0.998，Y軸截距應在100%響應值的2%以內，響應因子的相對標准差應不大於2.0%。
3.精密度
1)重復性
配製6份相同濃度的供試品溶液，由一個分析人員在盡可能相同的條件下進行測試，所得6份供試液含量的相對標准差應不大於2.0%。
2)中間精密度
配製6份相同濃度的供試品溶液，分別由兩個分析人員使用不同的儀器與試劑進行測試，所得12個含量數據的相對標准差應不大於2.0%。
4.專屬性
可接受的標准為：空白對照應無干擾，主成分與各有關物質應能完全分離，分離度不得小於2.0。以二極體陣列檢測器進行純度分析時，主峰的純度因子應大於980。
5.檢測限
主峰與噪音峰信號的強度比應不得小於3。
6.定量限
主峰與噪音峰信號的強度比應不得小於10。另外，配製6份最低定量限濃度的溶液，所測6份溶液主峰的保留時間的相對標准差應不大於2.0%。
7.耐用性
分別考察流動相比例變化±5%、流動相pH值變化±0.2、柱溫變化±5℃、流速相對值變化±20%時，儀器色譜行為的變化，每個條件下各測試兩次。可接受的標准為：主峰的拖尾因子不得大於2.0，主峰與雜質峰必須達到基線分離;各條件下的含量數據(n=6)的相對標准差應不大於2.0%。
8、系統適應性
配製6份相同濃度的供試品溶液進行分析，主峰峰面積的相對標准差應不大於2.0%，主峰保留時間的相對標准差應不大於1.0%。另外，主峰的拖尾因子不得大於2.0，主峰與雜質峰必須達到基線分離，主峰的理論塔板數應符合質量標準的規定。
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2. 如何建立氣相色譜分析方法
在實際工作中，當我們拿到一個待測定樣品，我們該怎樣如何利用氣相色譜儀來定性和定量，建立一套完整的分析方法是關鍵，下面魯創分析儀器有限公司色譜工程師介紹一些常規的步驟：
1、樣品的來源和預處理方法
氣相色譜儀GC能直接分析的樣品必須是氣體或液體，固體樣品在分析前應當溶解在適當的溶劑中，而且還要保證樣品中不含GC不能分析的組分（如無機鹽），可能會損壞色譜柱的組分。這樣，我們在接到一個未知樣品時，就必須了解的來源，從而估計樣品可能含有的組分，以及樣品的沸點范圍。如能確認樣品可直接分析。如果樣品中有不能用GC直接分析的組分，或樣品濃度太低，就必須進行必要的預處理，包括採用一些預分離手段，如各種萃取技術、濃縮和稀釋方法、提純方法等。
2、確定儀器配置
所謂儀器配置就是用於分析樣品的方法採用什麼進樣裝置、什麼載氣、什麼色譜柱以及什麼氣相色譜儀檢測器。
3、確定初始操作條件
當樣品准備好，且儀器配置確定之後，就可開始進行嘗試性分離。這時要確定初始分離條件，主要包括進樣量、進樣口溫度、檢測器溫度、色譜柱溫度和載氣流速。進樣量要根據樣品濃度、色譜柱容量和檢測器靈敏度來確定。樣品濃度不超過mg/mL時填充柱的進樣量通常為1-5uL，而對於毛細管柱，若分流比為50：1時，進樣量一般不超過2uL。進樣口溫度主要由樣品的沸點范圍決定,還要考慮色譜柱的使用溫度。原則上講，進樣口溫度高一些有利，一般要接近樣品中沸點的組分的沸點，但要低於易分解溫度。
4、分離條件優化
分離條件優化目的就是要在最短的分析時間內達到符合要求的分離結果。在改變柱溫和載氣流速也達不到基線分離的目的時，就應更換更長的色譜柱，甚至更換不同固定相的色譜柱，因為在氣相色譜儀中，色譜柱是分離成敗的關鍵。
5、定性鑒定
所謂定性鑒定就是確定色譜峰的歸屬。對於簡單的樣品，可通過標准物質對照來定性。就是在相同的色譜條件下，分別注射標准樣品和實際樣品，根據保留值即可確定色譜圖上哪個峰是要分析的組分。定性時必須注意，在同一色譜柱上，不同化合物可能有相同的保留值，所以，對未知樣品的定性僅僅用一個保留數據是不夠的，雙柱或多柱保留指數定性是GC中較為可靠的方法，因為不同的化合物在不同的色譜柱上具有相同保留值的幾率要小得多。
6、定量分析
要確定用什麼定量方法來測定待測組分的含量。我們常用的色譜定量方法不外乎峰面積（峰高）百分比法、歸一化法、內標法、外標法和標准加入法（又叫疊加法）。峰面積（峰高）百分比法最簡單，但最不準確。只有樣品由同系物組成、或者只是為了粗略地定量時該法才是可選擇的。相比而言，內標法的定量精度，因為它是用相對於標准物（叫內標物）的響應值來定量的，而內標物要分別加到標准樣品和未知樣品中，這樣就可抵消由於操作條件（包括進樣量）的波動帶來的誤差。至於標准加入法，是在未知樣品中定量加入待測物的標准品，然後根據峰面積（或峰高）的增加量來進行定量計算。其樣品制備過程與內標法類似但計算原理則完全是來自外標法。標准加入法定量精度應該介於內標法和外標法之間。
7、方法的驗證
所謂的方法驗證，就是要證明使用氣相色譜儀所開發方法的實用性和可靠性。實用性一般指所用儀器配置是否全部可作為商品購得，樣品處理方法是否簡單易操作，分析時間是否合理，分析成本是否可被同行接受等。可靠性則包括定量的線性范圍、檢測限、方法回收率、重復性、重現性和准確度等。
3. 如何進行體內葯物分析方法的建立和評價
一、分析方法的設定依據：
⑴重視並做好文獻總結、整理工作；
⑵充分了解待測葯物的特性及體內存在狀況；
⑶明確測定的目的要求；
⑷實驗室條件。
二、方法建立的一般步驟：
⑴以純品進行測定：以一定量純品按擬定方法進行測定。求得濃度與測定響應值之間（如吸收度、色譜峰高或面積等）的關系，濃度線性范圍，最適測定濃度，檢測靈敏度，測定的最適條件（pH、溫度、反應時間）等等。
⑵以經過純化處理過的空白樣品進行測定；
⑶空白樣品添加標准後的測定：血樣等樣品中添加一定量標准品後進行測定，求得樣品回收率數據，檢驗生物樣品對測定有無干擾等。
⑷體內實際樣品測定：有時用體外建立的方法去測定體內取得的實樣時，會得出錯誤的結論。故要強調對葯物體內過程有一定程度的了解。有時也採用專屬性強、已證明適用於體內實樣測定的步驟和方法作為對照測定，並以此來檢驗所建立的方法的實際可行性。
三、方法的評價：
⑴准確度(Accuracy)：測定結果與真值的符合程度。常用回收率(Recovery)數值間接反映測定的准確程度；也可通過與其他已建立的方法進行比較的辦法（參比方法）來加以反映。回收率100%當然好，但很難達到。重要的是每次測定要保持穩定。
⑵精密度(Precision)：測定結果與平均值的偏離程度。測定間偏差越小，對測定的要求也越高（花費大）；濃度與RSD值間存在反比關系，RSD在10%以內的方法可認為是可接受的。
⑶靈敏度(Sensitivity)：「一種方法可以檢測出有關化合物的最小量」。常用最低檢測限(Limit of detection,LOD)或最低檢測量(Limit of quantification;LOQ)來表示。LOD范圍在ng(10-9g)～10-18g。
⑷專屬性或選擇性(Specificity or Selectivity)：是指測定的信號（響應）是屬於被測葯物所特有的。若有干擾就需改進測定方法或改用具有分離能力（如色譜法的專屬性較吸收光度法為高）的方法或專屬性較強的方法進行。
⑸不同方法測得結果的相關程度(Degree of correlation)的比較：用一有相當專屬性和可*性的方法與新建方法同量測定，以相關系數γ(Correlation coefficient)表示相關程度。γ一般要求在0.95以上。
此外，還應從方法的可*性、每個樣品測定耗時多少、操作的難易及技術要求及儀器、設備要求、費用多少等等方面加以考慮。
4. 生物樣品分析方法建立過程中分離條件如何篩選
分離條件篩選時應考察生物基質中的應考察生物基質中的內源性物質及代謝產物對分離與檢測的干擾內源性物質及代謝產物對分離與檢測的干擾步步驟如下驟如下11空白溶劑試驗空白溶劑試驗——溶劑溶劑方法特異性方法特異性22空白生物基質試驗空白生物基質試驗——方法特異性方法特異性33模擬生物樣品試驗模擬生物樣品試驗——方法效能指標方法效能指標44實際生物樣品測試實際生物樣品測試——代謝產物代謝產物方法特異性方法特異性271待測葯物的非生物基質溶液待測葯物的非生物基質溶液通常為水溶液通常為水溶液——採用擬定的分析方法進行衍生化反應採用擬定的分析方法進行衍生化反應、、萃取分離等萃取分離等樣品預處理樣品預處理反應試劑反應試劑、、衍生化試劑衍生化試劑、、萃取溶劑等萃取溶劑等——測定響應信號測定響應信號如如HPLCHPLC峰面積或峰高峰面積或峰高考察目標考察目標——方法的特異性方法的特異性——空白值應盡可能小空白值應盡可能小並能有效校正並能有效校正28對色譜分析法而言——可通過可通過改變反應條件改變反應條件、、萃取方法或萃取條件萃取方法或萃取條件萃取溶萃取溶劑的極性劑的極性、、混合溶劑的配比混合溶劑的配比固相萃取填料性質固相萃取填料性質、、沖洗沖洗劑與洗脫劑及其用量等劑與洗脫劑及其用量等甚至甚至檢測器類型檢測器類型——空白試劑信號應空白試劑信號應不幹擾葯物的測定不幹擾葯物的測定
5. 如何建立氣相色譜分析方法
氣相色譜儀以氣體作為流動相（載氣）。當樣品由微量注射器注入進樣器汽化後，被載氣攜帶進入填充柱或毛細管色譜柱。由於樣品中的流動相（氣相）和固定相（液相或氣相）間分配或吸附系數的差異，在載氣的沖洗下各組分在兩相間作反復多次分配
6. 如何建立高效液相色譜法測定有關物質的方法
摘要 本文就如何建立TLC法測定有關物質的方法進行論述，系統地闡述了薄層色譜法各條件確定的原理，並列舉了質量標准制訂中存在的某些問題。
關鍵詞 薄層色譜法（TLC法） 有關物質 方法建立
有關物質是研究葯品中除主成分以外的雜質，它可能是原料葯合成過程中帶入的原料、中間體、試劑、降解物、副產物、聚合體、異構體以及不同晶型、旋光異構的物質，也可能是制劑過程中產生的降解物，或是在貯藏、運輸、使用過程中產生的降解物等[1]。這些雜質的存在直接反映葯品的有效性和安全性，故要對其進行研究，特別是在葯品申報的質量研究資料中需建立其檢測方法，並根據生產、穩定性考核等實際情況考慮是否在質量標准中制訂該檢查項，規定其限度。目前，有關物質的常用測定方法有高效液相色譜法(HPLC法)和薄層色譜法(TLC法)。
TLC的特點是快速、簡便，尤其是對無紫外吸收的雜質測定，更具有其應用價值。如能將TLC法與HPLC法有機地結合、或彼此間進行比對研究，便可得到更多、更為准確的有關雜質信息，做到兩方法間的相輔相成，相益得彰！本文將著重討論如何建立薄層色譜法測定有關物質的方法。
1．測定方法類型
常用的方法有雜質對照品法（適用於已知雜質）和自身（稀釋）對照法（適用於一般雜質檢查，雜質成分少且尚不能取得雜質對照品）。目前國內由於難以獲得雜質對照品、故一般均採用自身對照法。
2．展開劑的確定（即專屬性試驗）
專屬性的研究是提供被分析物在雜質和輔料存在時能被區分的證明，該點是色譜條件建立的關鍵。通常採用在被分析物的對照品或精製品中加入一定量的雜質或輔料，證明色譜條件可將各雜質與被分析物分離[1]。這里的關鍵是：將多少量的雜質加入到多少量的主成分中。正確的作法是將1%(w/w)濃度量的各雜質加入到100%濃度的主成分中，配製這樣的溶液來
驗證系統適用性。之所以如此配製，目的是模仿樣品中有可能存在的狀態，即有少量（1%左右）雜質存在時是否能與主成分達到完全分離，只有這樣才能比較客觀、科學地反映樣品中實際存在情況的（見圖1）；而不應把該溶液配製成：主成分與中間體相同濃度的。因為一者實際檢測時樣品中不可能存在此種情況；二者該濃度不易確定，目前國內申報資料中一般的作法均是配製成較低的一致濃度，這樣各斑點當然易於完全分離了（見圖2），但在實際測定時，由於主斑點急劇增大，很易將相鄰雜質包含於主成分斑點中。同樣，質量標准中的系統適用性試驗用溶液的配製方法亦如此。
（1，3，4為雜質，2為主成分）
圖1 圖2 （雜質濃度均為供試品溶液濃度的1%）
3．檢出條件的確定
其基本出發點是：主成分與相關雜質均應在該條件下顯色，且在相同濃度下，斑點大小應基本一致。薄層板的類型根據被測物質的性質來選用，測定有紫外吸收的物質通常選用GF254或GF365板；測定無紫外吸收、需噴顯色劑的，常選用硅膠G板或H板，選用該類薄層板時，顯色方法根據被測物質的結構式選取，但當有多個顯色方法時，應分別進行試驗，選取靈敏度最高的顯色方法。如醋酸氫化可的松有關物質的測定，中國葯典2000年版採用鹼性四氮唑藍試液顯色，美國葯典26版採用硫酸-乙醇(10:90)溶液顯色，兩者均為激素類葯物的顯色方法。醋酸氫化可的松屬於激素類中的腎上腺皮質激素，四氮唑法是腎上腺皮質激素的重要顯色方法；而硫酸-乙醇顯色法則主要是針對激素類中的雌激素的顯色反應，對於屬於腎上腺皮質激素類的醋酸氫化可的松則反應活性不強，結果兩法的靈敏度相差10倍以上。因此，檢出條件的確定，一定要在查閱文獻的基礎上，並根據試驗結果進行綜合考慮。
4．供試品溶液濃度的確定（靈敏度試驗——最低檢出限的測定）
供試品溶液濃度的設定在有關物質檢測中是至關重要的，濃度越高、越能反映樣品中雜質存在的情況，但若設定得過高，則會產生主斑點嚴重拖尾、「斷腰」等超載現象的發生，產生錯誤結論；若設定太低，又將達不到檢測雜質的目的，觀測不到雜質量的變化。其設定是根據最低點樣量和最大點樣量來綜合考慮的。
最低檢出限雖然是個絕對值，但真正的意義卻是其相對值，即相對於供試品溶液的濃度多少而言，所以測定結果不僅要羅列出其絕對值又應列出其相對值，這樣最低檢出限才有意義！最大點樣量則是通過不斷加大供試品溶液濃度，直至主斑點嚴重拖尾、「斷腰」等情況出現時來得到的。然後根據最低檢出限，採用「上推法」來確定：如一般設定雜質斑點小於1.0%對照斑點，對照溶液的濃度至少應為最低檢出濃度（即最低檢出限）的20~50倍，則供試品溶液濃度是最低檢出濃度的2000~5000倍；反過來，最低檢出濃度應至少達到供試品溶液濃度的0.02%~0.05%。應注意的是：由於最低檢出量和最大點樣量因試驗環境、薄層板質量以及即時試驗時其他各因素的不同而改變（即耐受性因數），故供試品溶液的濃度在保證小於最大進樣量的情況下，可在此基礎上設定得再高一些，以保證該濃度可適用於各種條件下。舉例說明見表1（規定雜質限度為1.0%）。
表1 最低檢出量、最大點樣量、供試品溶液和對照溶液濃度之間的比例關系
最大點樣量
供試品溶液
對照溶液
最低檢出量 濃 度 8mg/ml 3mg/ml 30μg/ml 1μg/ml 點樣量 10μl 10μl 10μl 10μl 絕對量 30μg 0.3μg 10ng 相對於樣品測定濃度的 100% 1.0% 0.02% 倍 數 關 系 5000倍 30倍 「基準點」
供試品溶液濃度也可設定得再高些，但不可超過最大點樣量。
5．加樣回收試驗（即准確性試驗）
准確性試驗可採用在預經有關物質測定後的樣品中，加入已知量雜質的方法來評價。准確稱取各雜質，將含有1%(w/w)濃度的各雜質加入到樣品溶液中，以驗證所採用的薄層測定條件是否可分離檢測出相應的各雜質以及樣品中已存在的雜質是否累加，斑點是否加深。該原理同前面所述的專屬性研究是一致的。
6．強力破壞試驗
該項研究是為了揭示原料葯內在穩定性的特性，它是開發研究的一部分。這些試驗是在比加速試驗更劇烈的條件下進行的，其能夠包含葯品在銷售過程中所遇到的劇烈條件。可取一批樣品通過強光、高溫、高濕、氧化破壞、以及酸鹼破壞來證明該展開條件能分離檢測出雜質。
7．展開距離
測定時一定要採用25cm、長薄層板，展開距離應盡可能長一些，以使雜質與主成分盡量分離。如用短板，易造成臨近主斑點的雜質斑點「躲進」主斑點中。但同時又應注意，距離拉大，斑點分散，會損失最低檢出限，降低靈敏度，故應綜合考慮。
8．其它的因素
展開溫度應盡量控制在20~25℃之間，尤其在冬季，應注意環境的溫度，如太低，將嚴重影響展開效果。另層析缸的蓋兒，應塗抹凡士林油，以保證整個試驗過程中，層析缸的密封，避免展開劑揮發；並應在展開前，預先傾入展開劑，以使層析缸內的空氣飽和，達到最佳的展開效果。薄層板由於有自製、市售，質量不一也應注意。
二．討論
1． 質量標准中的系統適用性試驗，最好能將最難分離的雜質訂入系統適用性試驗用溶液的配製，將此雜質的濃度配製為主成分濃度的1%，或0.5%，或0.2%（依據雜質限度而定）進行試驗，驗證分離度後，再進行樣品的測定，以確保試驗的准確進行。
2． 質量標准中，應配製系列濃度的對照溶液（即梯度對照），以對雜質有「半定量」的概念，這可更好地評價雜質存在的情況；並應規定雜質的個數及最大雜質斑點的限度，使質量標准更完善、科學。經查閱，中國葯典薄層色譜法測定有關物質的有70個品種，僅有2個品種採用了梯度對照，絕大部分品種僅是制定了對照溶液，均未規定雜質個數，和最大雜質斑點限度，如有若干個雜質斑點也無法判定；而英國葯典和美國葯典則幾乎每個品種均採用梯度對照，並規定雜質個數和最大雜質斑點限度，這一點值得學習和推廣。
3． 錯誤的一種誤區，認為HPLC法完全替代了TLC法，這是不正確的，一定要做到相互補充、相互論證、相互參考才是最客觀、最科學的！
本文是在參閱了日本《分析方法驗證》一書和大量日本國內新葯申報資料中質量研究部
分的內容所寫而成。
7. 如何建立復雜多組分樣品的高效液相色譜分析條件
1,為進行分離,可以根據樣品的組分將流動相和固定相的組合最佳化.如果熟悉液相色譜,這是非常有利的,但對初學者來說,這是困難的. 2,適用樣品范圍廣,80%的分析對象可藉此法分析. 3,可以使用高效的分離柱,易於分離復雜的多組分混合物. 4,把被分離的組分溶解在流動相中,可以全部回收之. 5,可以使用多種非破壞性高靈敏度和選擇性的檢測器,把幾種檢測器串聯起來,根據其對應特性,獲取與定性有關的重要信息. 6,只能檢測從色譜柱流出的組分. 7,由於沒有通用型高靈敏度檢測器,所以在分析未知混合物而沒有色譜峰的時候,無法確定其原因是分離條件不合適,還是檢測器沒有響應. 8,採用尺寸排斥色譜法時,從低分子到高分子的樣品全部流出,而且流出順序是從高分子量開始,故可根據保留容量推測分子量,最適於做未知樣品的組成分析. 9,測定精度好.因為注入精度比氣相色譜好,故可以用絕對工作曲線. 10,雖然示差折光檢測器為通用型檢測器,但和氣相色譜的熱導檢測器和氫火焰檢測器相比,由於化合物之間的響應不同,所以用峰面積百分數求由多種化合物組成的混合物時問題較多. 11,要限制色譜柱的使用條件（溫度、壓力、流動相等）.而且與氣相色譜相比,性能隨時間的變化較大.必須定期用標准品在標准條件下檢查色譜柱的性能.若按照不同的樣品對象,固定使用色譜柱,對色譜柱的壽命是有利的. 12,製作色譜柱需要特殊裝置和專門技能. 13,與氣相色譜法相比,由於共存物質對分離的影響小,易於制備分析樣品. 14,柱外死體積對色譜柱的性能有重大的綜合性影響,而且連接方法依儀器製造廠而異.
8. 建立生物樣品分析方法，對定量分析方法進行驗證包括哪些內容
1
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生物樣品定量分析方法驗證指導原則
1.
范圍
准確測定生物基質（如全血、血清、血漿、尿）中的葯物濃度，對於葯物和制劑研發非常重要。這些數據可被用於支持葯品的安全性和有效性，或根據毒動學、葯動學和生物等效性試驗的結果做出關鍵性決定。因此，必須完整地驗證和記錄應用的生物分析方法，以獲得可靠的結果。
本指導原則提供生物分析方法驗證的要求，也涉及非臨床或臨床試驗樣品實際分析的基本要求，以及何時可以使用部分驗證或交叉驗證，來替代完整驗證。
生物樣品定量分析方法驗證和試驗樣品分析應符合本指導原則的技術要求。應該在相應的生物樣品分析中遵守GLP原則或GCP原則。
2.
生物分析方法驗證
2.1
分析方法的完整驗證
分析方法驗證的主要目的是，證明特定方法對於測定在某種生物基質中分析物濃度的可靠性。此外，方法驗證應採用與試驗樣品相同的抗凝劑。一般應對每個物種和每種基質進行完整驗證。當難於獲得相同的基質時，可以採用適當基質替代，但要說明理由。
一個生物分析方法的主要特徵包括：選擇性、定量下限、響應函數和校正范圍（標准曲線性能）、准確度、精密度、基質效應、分析物在生物基質以及溶液中儲存和處理全過程中的穩定性。
有時可能需要測定多個分析物。這可能涉及兩種不同的葯物，也可能涉及一個母體葯物及其代謝物，或一個葯物的對映體或異構體。在這些情況下，驗證和分析的原則適用於所有涉及的分析物。
9. 氣相色譜分析方法的建立常規步驟有哪些
樓主你好：
氣相色譜分析方法的常規步驟
在實際工作中，當我們拿到一個樣品，我們該怎樣定性和定量，建立一套完整的分析方法是關鍵，下面介紹一些常規的步驟：
1、樣品的來源和預處理方法
GC能直接分析的樣品通常是氣體或液體，固體樣品在分析前應當溶解在適當的溶劑中，而且還要保證樣品中不含GC不能分析的組分（如無機鹽），可能會損壞色譜柱的組分。這樣，我們在接到一個未知樣品時，就必須了解的來源，從而估計樣品可能含有的組分，以及樣品的沸點范圍。如果樣品體系簡單，試樣組分可汽化則可直接分析。如果樣品中有不能用GC直接分析的組分，或樣品濃度太低，就必須進行必要的預處理，如採用吸附、解析、萃取、濃縮、稀釋、提純、衍生化等方法處理樣品。
2、確定儀器配置
所謂儀器配置就是用於分析樣品的方法採用什麼進樣裝置、什麼載氣、什麼色譜柱以及什麼檢測器。
一般應首先確定檢測器類型。碳氫化合物常選擇FID檢測器，含電負性基團（F、Cl等）較多且碳氫含量較少的物質易選擇ECD檢測器；對檢測靈敏度要求不高，或含有非碳氫化合物組分時，可選擇TCD檢測器；對於含硫、磷的樣品可選擇FPD檢測器。
對於液體樣品可選擇隔膜墊進樣方式，氣體樣品可採用六通閥或吸附熱解析進樣方法，一般色譜僅配置隔膜墊進樣方式，所以氣體樣品可採用吸附-溶劑解析-隔膜墊進樣的方式進行分析。
根據待測組分性質選擇適合的色譜柱，一般遵循相似相容規律。分離非極性物質時選擇非極性色譜柱，分離極性物質時選擇極性色譜柱。色譜柱確定後，根據樣本中待測組分的分配系數的差值情況，確定色譜柱工作溫度，簡單體系採用等溫方式，分配系數相差較大的復雜體系採用程序升溫方式進行分析。更多質量檢測、分析測試、化學計量、標准物質相關技術資料請參考國家標准物質食品檢測標准物質 http://www.rmhot.com/plist_1/plist_1_12_0_1.html
常用的載氣有氫氣、氮氣、氦氣等。氫氣、氦氣的分子量較小常作為填充柱色譜的載氣；氮氣的分子量較大，常作為毛細管氣相色譜的載氣；氣相色譜質譜用氦氣作為載氣。
3、確定初始操作條件
當樣品准備好，且儀器配置確定之後，就可開始進行嘗試性分離。這時要確定初始分離條件，主要包括進樣量、進樣口溫度、檢測器溫度、色譜柱溫度和載氣流速。進樣量要根據樣品濃度、色譜柱容量和檢測器靈敏度來確定。樣品濃度不超過10mg/mL時填充柱的進樣量通常為1-5uL，而對於毛細管柱，若分流比為50：1時，進樣量一般不超過2uL。進樣口溫度主要由樣品的沸點范圍決定，還要考慮色譜柱的使用溫度。原則上講，進樣口溫度高一些有利，一般要接近樣品中沸點最高的組分的沸點，但要低於易分解溫度。
4、分離條件優化
分離條件優化目的就是要在最短的分析時間內達到符合要求的分離結果。在改變柱溫和載氣流速也達不到基線分離的目的時，就應更換更長的色譜柱，甚至更換不同固定相的色譜柱，因為在GC中，色譜柱是分離成敗的關鍵。
5、定性鑒定
所謂定性鑒定就是確定色譜峰的歸屬。對於簡單的樣品，可通過標准物質對照來定性。就是在相同的色譜條件下，分別注射標准樣品和實際樣品，根據保留值即可確定色譜圖上哪個峰是要分析的組分。定性時必須注意，在同一色譜柱上，不同化合物可能有相同的保留值，所以，對未知樣品的定性僅僅用一個保留數據是不夠的，雙柱或多柱保留指數定性是GC中較為可靠的方法，因為不同的化合物在不同的色譜柱上具有相同保留值的幾率要小得多。條件允許時可採用氣相色譜質譜聯機定性。
6、定量分析
要確定用什麼定量方法來測定待測組分的含量。常用的色譜定量方法不外乎峰面積（峰高）百分比法、歸一化法、內標法、外標法和標准加入法（又叫疊加法）。峰面積（峰高）百分比法最簡單，但最不準確。只有樣品由同系物組成、或者只是為了粗略地定量時該法才是可選擇的。相比而言，內標法的定量精度最高，因為它是用相對於標准物（叫內標物）的響應值來定量的，而內標物要分別加到標准樣品和未知樣品中，這樣就可抵消由於操作條件（包括進樣量）的波動帶來的誤差。至於標准加入法，是在未知樣品中定量加入待測物的標准品，然後根據峰面積（或峰高）的增加量來進行定量計算。其樣品制備過程與內標法類似但計算原理則完全是來自外標法。標准加入法定量精度應該介於內標法和外標法之間。
7、方法的驗證
所謂的方法驗證，就是要證明所開發方法的實用性和可靠性。實用性一般指所用儀器配置是否全部可作為商品購得，樣品處理方法是否簡單易操作，分析時間是否合理，分析成本是否可被同行接受等。可靠性則包括定量的線性范圍、檢測限、方法回收率、重復性、重現性和准確度等。
10. 如何建立好葯物含量的高效液相色譜分析方法
1，首先必須去進行配製葯物溶液前處理的工作。找出該葯物的溶解性，探索出該葯物的有效溶劑，使該葯物能在該溶劑中充分溶解，這是葯物溶液配製的前處理必然途徑，也是進行高效液相色譜含量分析的首要條件。
2，然後就是根據該葯物配製溶液的前處理方法，配製好適當濃度的葯物溶液，利用該葯物溶液，在紫外-可見分光光度計上進行紫外掃描，找到該葯物的最大吸收波長，確立適合的高效液相色譜分析的檢測波長。因為它是進行高效液相色譜含量分析的基本條件
3，再是色譜柱的選擇：根據葯物的極性來選擇合適極性的色譜柱類型
4，再是流動相的確立。配製一系列的流動相，考察合適的流動相。
5，再是准確度考察。通過精密度、重復性和重現性的考察來衡量儀器的准確度
6，接著是線性關系考察。配製不同濃度的一系列溶液，進行其溶液的色譜掃描。根據所得的不同濃度下的葯物峰面積作為縱坐標（Y軸）、以溶液濃度為橫坐標（X軸）進行線性回歸，得到其線性圖，考察其線性程度，即線性相關系數R=？。考察的目的就是：為了我們在做含量分析時，選擇一個合適的濃度進行檢測，不至於你配製的待測溶液濃度范圍不在線性范圍之內，造成測量結果的錯誤。
7，再是最低檢測濃度和檢測限的考察。目的是為了考察這種方法的實用性，是否符合痕量分析的要求。
8，再是回收率考察。目的是考察方法的准確性。
9，再是穩定性考察。目的是考察試驗方法的時間性，指導我們在分析檢測時，建立合適的溶液配製到進樣的時間段，保證實驗結果的准確性。
10，最後是專屬性考察。