冷凍乾燥保藏的微生物有哪些

Ⅰ 微生物菌種保藏的方法有哪些

菌種的優劣是食用菌生產成敗的關鍵。菌種是國家重要的生物資源，也是微生物工廠首要的生產資料。由於微生物繁殖快、易變異，因此微生物菌種特別需要妥善保藏。世界各國對微生物菌種都很重視。中國科學院微生物研究所專門設立了菌種的保藏機構，為各生產單位收藏和供應各種優良菌種。當然就具體的生產單位而言，大量的生產用菌種還得靠自己來生產和保藏。
菌種保藏的目的：是使優良菌種經過較長時間後，仍能保持菌種的優良性狀、生活能力及純度，降低菌種的衰亡速度，確保菌種的純一，防止雜菌污染及絕種。
保藏菌種的方法：人們在長期的生產實踐中，積累了不少保藏菌種的經驗，常用的保藏方法有：斜面低溫保藏法、液體石蠟保藏法、砂土管保藏法、濾紙片保藏法、穀粒保藏法等。常用保藏菌種的方法有以下幾種：
（1）斜面低溫保藏法這是最簡單最普通的保藏方法。首先將菌種在適宜的斜面培養基（一般PDA）上培養成熟後，選擇菌絲生長粗壯，邊緣保存。一般保存溫度4～6℃，除草菇和銀耳菌種外（10～15℃），此方法對其他食用菌都適宜，一般菌種可保藏2～4個月，所以需定時移接。此法保藏雖然方便，但是保藏時間短，需經常轉管，也很容易發生衰退變異現象。因此，不能用作長期保藏，最好與其他方法結合起來保藏。
另外，為了減少保藏期間培養基水分蒸發，瓊脂最好加到2.5%。為防止菌種在保藏過程中產酸分的積累，應加入0.2%的磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀等緩沖鹽類，同時，培養成熟後，最好將棉塞管口外剪平，並用礦蠟封或換以無菌木塞，這樣做也可以減少培養基水分的散失，延長保存時間。
在農村如果沒有冰箱，可採用土法保藏。即把保藏用的斜面菌種換上無菌橡皮塞，並用礦燭蠟封後密閉的廣口瓶中，懸入井底保藏。（2）貯藏室保藏法原種和栽培種一般只在貯藏室短期保藏，貯藏室溫度0～10℃為好。室內應清潔、乾燥、無光，應經常檢查溫度和濕度，以降低其生活力，減少變異退化，防止雜菌污染，避免過早出菇。溫度越高，保存的時間越短。

Ⅱ 微生物的保藏技術各自特點

1.傳代培養保藏，方法簡便但是其缺點也很明顯菌種管棉塞經常容易發霉，菌株遺傳性狀易變異，需定期轉種，工作量大，且易被污染；2.冷凍保藏，適用抗凍能力強的微生物，注意保藏過程中菌種的退化。3.乾燥保藏，主要適用於能形成孢子或孢子囊的微生物菌種，其中有包括沙土管保存和冷凍真空保藏。前者簡單易行，適合實驗室以及放線菌為菌種的保存，後者適合絕大部分菌種的保藏包括噬菌體和立克次氏體等的保藏。望採納

Ⅲ 微生物菌種的微生物菌種保藏方法

有些微生物當遇到冷凍或乾燥等處理時，會很快死亡，因此在這種情況下，只能求助於傳代培養保存法。傳代培養就是要定期地進行菌種轉接、培養後再保存，它是最基本的微生物保存法，例如酸奶等常用生產菌種的保存。
傳代保存時，培養基的濃度不宜過高，營養成分不宜過於豐富，尤其是碳水化合物的濃度應在可能的范圍內盡量降低。培養溫度通常以稍低於最適生長溫度為好。若為產酸菌種，則應在培養基中添加少量碳酸鈣。 即使微生物混懸於適當溶液中進行保存的方法。常用的有：
① 蒸餾水保存法：適用於黴菌、酵母菌及絕大部分放線菌，將其菌體懸浮於蒸餾水中即可在室溫下保存數年。本法應注意避免水分的蒸發。
② 糖液保存法：適用於酵母菌，如將其菌體懸浮於10%的蔗糖溶液中，然後於冷暗處保存，可長達10年。除此之外，也可使用緩沖液或食鹽水等進行保存。 將微生物吸附在適當載體上進行乾燥保存的方法。常用的有方法包括以下幾種：
①土壤保存法
主要用於能形成孢子或孢囊的微生物菌種的保藏。方法是在滅菌的土壤中加入菌液，立即在室溫下進行乾燥或使菌體繁殖後再乾燥，然後冷藏或在室溫下密封保存。保存用的土壤原則上以肥沃的耕土為宜，土壤需風干、粉碎、過篩和滅菌。
使微生物在土壤中繁殖後進行乾燥保存的方法是：取適量土壤(5克)置於塞有棉塞的試管中，加水或加入充分稀釋的液體培養基(以含水量為土壤最大持水量的60%為宜)，然後高壓滅菌。再將需保存的微生物進行大量接種，培養至菌絲能用肉眼確認的程度為止，移入乾燥器中經短時間乾燥或風干後密封，冷藏或室溫保存。
②砂土保存法
取清潔的砂，過60目篩去掉大砂粒，並用磁鐵吸去砂中鐵屑，再用NaOH溶液、10% HCl溶液和水交替清洗數次，乾燥後，置於試管或安瓶管中保持2～3cm深，再經乾熱滅菌後，加入1ml菌種培養液，經充分混勻後，放入真空乾燥器中，完全乾燥後熔封保存。也可用二份洗凈的砂(經HCl預處理)和一份貧瘠、過篩的黃土攙和後滅菌，再進行菌種保藏。
③硅膠保存法
以6～16目的無色硅膠代替砂子，乾熱滅菌後，加入菌液。加菌液時，由於硅膠的吸附熱常使溫度升高，因而需設法加以冷卻。
④磁珠保存法
將菌液浸入素燒磁珠(或多孔玻璃珠)後再進行乾燥保存的一種方法。在螺旋口試管中裝入1/2管高的硅膠(或無水CaSO4)，上鋪玻璃棉，再放上10～20粒磁珠，經乾熱滅菌後，接入菌懸液，最後冷藏、室溫保藏或減壓乾燥後密封保藏。本法對酵母菌很有效，特別適用於根瘤菌，可保存長達兩年半時間。
⑤麩皮保存法
在麩皮內加入60%的水，經滅菌後接種培養，最後乾燥保藏。
⑥紙片(濾紙)保存法
將滅菌紙片浸入培養液或菌懸液中，常壓或減壓乾燥後，置於裝有乾燥劑的容器內進行保存。
寄主保存法
微生物侵入其寄主後加以保存的方法。 ① 低溫冰箱保存法(-20℃、-50℃或-85℃)：低溫冷凍保存時使用螺旋口試管較為方便，也可在棉塞試管外包裹塑料薄膜。保存時菌液加量不宜過多，有些可添加保護劑。此外，也可用φ5mm的玻璃珠來吸附菌液，然後把玻璃珠置於塑料容器內，再放入低溫冰箱內進行保存的。
② 乾冰保存法(-70℃左右)：即將菌種管插入乾冰內，再置於冰箱內進行冷凍保存。
③ 液氮保存法(-196℃)：是適用范圍最廣的微生物保存法。 它的原理是首先將微生物冷凍，然後在減壓下利用升華現象除去水分。從菌體中除去大部分水分後，細胞的生理活動就會停止，因此可以達到長期維持生命狀態的目的。該方法適用於絕大多數微生物菌種(包括噬菌體和立克次氏體等)的保存。

Ⅳ 菌種保存的方法有哪些，菌種傳代操作規程

菌種保存的方法有斜面低溫保藏法、液體石蠟覆蓋保藏法、沙土保藏法、濾紙保藏法、甘油管保存法、冷凍乾燥保存法。1、斜面低溫保藏法:將菌種接種到適合的固體斜面培養基上，用油紙將棉塞部分包紮好，然後轉移至2-8°C的冰箱中進行保存。2、液體石蠟覆蓋保藏法:使用液體石蠟將斜面菌覆蓋住，使其和空氣隔絕。
一、菌種保存的方法有哪些
1、斜面低溫保藏法
(1)將菌種接種到適合的固體斜面培養基上，等到菌種充分生長過後，使用油紙將棉塞部分包紮好，然後轉移至2-8°C的冰箱中進行保存。
(2)如果是黴菌、放線菌及有芽孢的細菌，一般可以保存2-4個月左右，需要移種一次。如果是酵母菌，一般可以保存2個月左右，需要每個月移種一次。
2、液體石蠟覆蓋保藏法
(1)將液體石蠟裝在三角燒瓶中，並使用棉塞塞好，用牛皮紙進行包紮，然後在0.1MPa，121.3°C的環境下滅菌30分鍾左右，接著將其放置在40°C的溫箱之中，將水汽蒸發掉。
(2)將需要保藏的菌種，用適合的斜面培養基進行培養，得到健壯的孢子或者是菌體。
(3)使用滅菌過的吸管將液體石蠟吸出，注入斜面上，用量為高出斜面頂端1cm左右為宜。
(4)將試管直立，放置在低溫或者是室溫之下進行保存。
(5)黴菌、放線菌、芽孢細菌可以保藏2年以上不死，酵母菌可以保藏1-2年，一般無芽孢細菌可以保藏1年，腦膜炎球菌可以保藏3個月左右(37°C環境下)。
3、沙土保藏法
(1)准備好河沙，加入10%稀鹽酸，然後加熱煮沸30分鍾左右，將裡面的有機質去掉，然後將酸水倒掉，用自來沖洗至ph為中性，接著烘乾，過篩(40目篩子)，去掉粗顆粒。
(2)准備好非耕作層的不含腐植質的瘦黃土或紅土，浸泡洗滌數次，直至ph為中性，然後烘乾，碾碎，過篩(100目篩子)，去掉粗顆粒。
(3)將沙和土按照2:1的比例混合，裝入試管或者是安瓿管中，塞好棉塞，在1212°C的環境下滅菌30分鍾左右。
(4)將菌種在斜面培養基中培養，得到健壯的菌體，然後向斜面培養物中注入3-5ml無菌水，洗下細胞或孢子製成菌懸液。
(5)使用滅菌過的吸管吸取菌懸液，然後均勻滴入沙土管中(0.2-0.5ml/管)。如果是放線菌或黴菌，可以直接挑取孢子拌入沙土管中。
(6)真空抽去沙土管中的水分。
(7)將沙土管用火焰熔封，然後存放在低溫(4-6°C)乾燥處保藏，或者是將沙土管用牛皮紙或塑料紙包好，放置在乾燥器內保存。保存期間，每隔6個月左右檢查一次菌種存活性。
4、濾紙保藏法
(1)准備好濾紙條(0.5×1.2cm)，安瓿管(0.6×8cm)，然後每個安瓿管放置1-2張濾紙條，塞上棉塞，在0.1MPa，121°C的環境下滅菌30分鍾左右。
(2)將菌種在適合的斜面培養基上培養，得到健壯的菌體。
(3)在滅菌培養皿中滴加1-2ml的滅菌脫脂牛乳，並取數環菌苔在牛乳內混合均勻，製成濃懸液，然後使用鑷子從安瓿管中取出濾紙條，浸入菌懸液中，吸飽後，放回安瓿管中，塞上棉塞。
(4)將安瓿管放入乾燥器中(內有五氧化二磷作吸水劑)，並用真空泵抽氣至干。
(5)將棉花塞入管內，用火焰熔封，然後放置在低溫環境下保存。
5、甘油管保存法
(1)准備好80%的甘油，然後進行高壓蒸汽滅菌處理。
(2)將菌種在適合的斜面培養基上培養，並使用無菌水注入，製成成高濃度的菌懸液。
(3)取出1ml的甘油和菌液混合均勻，讓甘油的濃度變為10-30%左右，然後放置在零下70°C的環境下進行保存。
6、冷凍乾燥保存法
在低溫下快速凍結細胞，然後在真空條件下進行乾燥，讓微生物的生長和酶活動停止，同時為了保證細胞在冷凍和水分升華的過程中不受損害，應當使用保護劑來制備細胞細胞懸液(菌在凍結和脫水過程中起到保護作用的溶質)，通過氫鍵和離子鍵對水和細胞所產生的親和力來穩定細胞成分的構型。
二、菌種傳代操作規程
1、點燃酒精燈，在火焰旁的上方灼燒接種環。
2、將原有的菌種斜面培養基(菌種管)和待接種的新斜面培養基(接種管)用左手的拇指、食指和中指夾住，菌種管在前，接種管在後，然後斜持試管(45°)，讓試管內斜面向上，兩個試管的口子平齊。
3、右手在火焰旁邊轉動兩管的棉塞，然後右手拿著接種環的柄端，垂直將接種環在火焰上灼燒，頂端的環必須燒紅，而且凡是接種時進入試管的部分，均應通過火焰灼燒。
4、使用右手的小指和手掌之間以及無名指和小指之間，將兩管的棉塞拔出，拿住，然後將試管在火焰上通過。
5、將接種環插入菌種管內，接觸無菌苔生長的培養基，待冷後，從斜面上挑取少許菌苔，然後迅速插入接種管，在斜面上輕輕劃線接種(由下而上劃直線，然後由下往上劃曲線)。
6、接種完畢後，將管口通過火焰滅菌，並將棉塞塞上。

Ⅳ 保藏菌種的方法有哪些

1、傳代培養保藏法：包括又有斜面培養、穿刺培養、皰肉培養基培養等，培養後於4-6℃冰箱內保存。

2、液體石蠟覆蓋保藏法：液體石蠟覆蓋保藏法是傳代培養的變相方法，能夠適當延長保藏時間。

3、載體保藏法：載體保藏法是將微生物吸附在適當的載體，如土壤、沙子、硅膠、濾紙上，而後進行乾燥的保藏法。

4、寄主保藏法：寄主保藏法用於目前尚不能在人工培養基上生長的微生物。

5、冷凍乾燥保藏法：先使微生物在極低溫度（-70℃左右）下快速冷凍，然後在減壓下利用升華現象除去水分（真空乾燥），其中真空冷凍乾燥法最常見。

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菌種保藏的原理：

菌種保藏有多種方法，其原理大多大同小異，主要是運用一些方式盡量降低生物體內的代謝，達到延長生命，減少變異的目的。通常採用的方法為低溫、缺氧、乾燥。

低溫主要對菌種產生兩方面的影響，首先，較低的溫度可以減緩機體細胞的酶活，降低新陳代謝，達到保藏菌種的目的。其次，低溫同時會導致菌體誘發菌絲自溶機制，如果降溫過程失誤，同樣會造成機體的機械損傷和溶質損傷。

Ⅵ 常用的菌種保存方法有哪些

菌種保藏是食用菌產業的一項基礎工作，是確保野生種質資源基因留存和現有生產用種遺傳性能相對穩定的必要手段。菌種保藏的方法多種多樣，有的雖然保藏效果好，但投資高或操作繁雜。在生產實踐中，更需要設備投入少，能保障菌種不死亡、不污染、最大限度地保持優良種性的簡便方法，如斜面低溫短期保藏和自然基質較長期保藏相結合的方法。

一般而言，對母種進行長期保存，對原種進行短期保存。須保證優良菌種的性狀和活力不發生變異，不死亡，不被污染，確保其純度。因此，保存方法應具備取材容易、操作方便、菌種不易退化、長期保存不污染雜菌等優點。常用的菌種保存方法如下：

（一）斜面低溫保藏 該法的優點是保藏方便且所佔空間較小。具體做法是：菌絲長滿斜面後，放在0～5℃保存。以後每隔一定時間（2～3個月）轉管一次。轉管保存不能長期用PDA培養基，否則種性易退化，灰樹花降解木質纖維素的能力減弱。因此隔一定時間（1年左右）須把菌種轉接到木屑培養基上復壯，之後挑選健壯無污染的菌絲再轉回PDA培養基保存。在長期保存過程中，要防棉塞受潮滋生雜菌。菌種試管口最好用蠟燙封，以防培養基內水分過快蒸發。增加瓊脂用量（2.5%～3%）可減緩水分蒸發。還要防止菌種管上的標簽脫落而造成種系混雜。

斜面低溫保藏方法簡便易行，能隨時觀察保藏菌株的活力和純度，一旦染雜，肉眼能及時發現。

（二）自然基質保藏 此法是根據灰樹花的特性，利用自然基質保藏其菌種的方法。灰樹花是木腐菌，可以採用以木屑為主料的培養基。自然基質營養全面，且大部為緩釋養分，不易產生營養過剩或飢餓；其次，培養基理化性狀好，可吸收或緩沖菌絲代謝出的有害物質，水分與通氣協調平衡，部分菌絲扎入基質內生長，不裸露於空氣中，菌絲呼吸強度低，生命力強。

1.原料與配方 粗、細木屑比例適當，採用板栗樹木屑最佳，粗木屑粒徑為2毫米左右，細木屑為一般圓盤鋸屑，粗、細的比例為1∶2，添加干木屑重量20%的麩皮和1%的糖，含水率為60%左右。這樣的基質通氣性好，營養豐富且供菌絲分解利用的時間長，長到基質內部的菌絲比包裹在基質外部暴露於空氣中的菌絲耐受性強。不同粒徑的基質比例適當，還能協調氣與水的矛盾。粗粒過多，架空菌絲多；細粒過多，透氣性差，菌絲生長慢。應用配方如下：

栗木屑78%，麩皮20%，石膏1%，蔗糖1%，水65%配料，裝入較粗大的試管中，裝料量為試管的1/3～1/2，1.5千克/厘米2滅菌1.5小時。冷卻後，接入需保藏的菌種，在28℃下培養，待菌絲長滿木屑培養基時取出換上無菌橡皮塞，在0～5℃冰箱內保藏1～2年轉管一次。

2.容器與裝量 採用容量250毫升的葡萄糖玻璃瓶，清洗潔凈，裝量一般不超過玻璃瓶容量的3/5，填料不能過滿，瓶壁所殘留的顆粒須擦拭乾凈，否則保藏的菌種易引起污染。

3.滅菌和冷藏 滅菌時若採用棉塞封口，基質表層易失水，接種成活率低，即使菌絲復活，生長也很緩慢，所以最好採用聚丙烯膜封口，接種後換用無菌棉塞培養，待菌絲長滿後再換成有孔滅菌膠塞冰箱保藏。

用上述方法保藏的菌種經3年貯放後，接出成活率均達90%以上，出菇驗證產量及子實體形態特徵均無明顯變化。因此，自然基質保藏法具有保存期長，菌種遺傳性能相對穩定的特點。

（三）木粒PDA斜面保藏 灰樹花在自然狀態下易發生於栗樹根部，這說明其營養需求較為特殊。根據灰樹花這種習性，在PDA基礎上添加適量的栗樹木粒製成母種培養基。在多年的使用中發現，用該培養基培養的母種生長勢好，在轉接原種時，適應能力強，萌發定植快；用作菌種保藏基質時，保藏時間長，並能很好保持菌種的優良性狀。

1.木粒PDA的製作 選取栗樹邊材，加工成0.3～0.5厘米的顆粒，及時烘乾或曬干備用。稱取葡萄糖10克，KH2PO41克，1溶解於1升清水中配製成營養液。將營養液倒入盛有木粒的小鋁鍋中，營養液以完全浸沒木粒為准。煮沸10分鍾，以加快木粒對營養液的吸收速度，起鍋靜置30分鍾讓木粒吸足營養液。撈出木粒，瀝掉表面的水，裝入試管，裝量為試管長的1/6，最多不得超過試管長的1/5，否則在擺制斜面時，不易使木粒均勻分散於斜面的表面上。

選取新鮮的馬鈴薯，去皮並切成薄片，稱取200克放入小鋁鍋中，加入1升清水，文火煮沸30分，趁熱過濾取汁，並補足1升的體積。稱取瓊脂20克，葡萄糖20克，KH2PO4 2克，MgSO47H2O 2克。先將瓊脂剪碎，加入到馬鈴薯濾液中，繼續用文火加熱，使瓊脂溶化。待瓊脂完全溶化後，加入稱好的其他3種營養成分，攪拌使這些物質溶解均勻，趁熱裝入已裝有木粒的試管中，裝至試管長的1/3處，塞上棉塞。

在0.8～1千克/厘米2蒸氣壓下滅菌40分，待氣壓降至0時，開蓋取出，趁熱輕輕抖拍試管，使木粒分散後即可擺制斜面，並使木粒呈半裸狀分布於斜面上，待凝固後便製成了木粒PDA培養基。

2.生長及保藏效果 木粒PDA斜面上培養的灰樹花母種，菌絲生長迅速、良好，12天即可長滿試管，但菌絲的後期生長勢更為粗壯、濃密，後勁足。轉接原種時，菌種適應力強，定植快。這表明，灰樹花菌絲的生長速度、生長勢不僅取決於本身的遺傳性，而且很大程度上取決於培養基的營養。常規PDA的營養成分，主要是可溶性的速效性營養，前期營養豐富，營養利用直接，因而前期菌絲生長迅速、良好，後期營養則不足，菌絲生長不良，長勢欠佳。木粒PDA由於在增添了木粒這一緩效性營養，就木腐性的灰樹花而言，營養配伍合理，補充了菌絲生長後期所需的營養，因此後勁足。

菌絲體對基質的分解利用是通過菌絲細胞分泌的胞外酶，將基質中的大分子營養分解成小分子營養後才被吸收利用的，而這些胞外酶大多為誘導酶，其合成與分泌受基質的誘導和分解產物阻遏機制調節。就纖維素酶而論，許多易代謝碳源（如葡萄糖等）具有引起酶合成阻遏作用，同時伴隨著菌絲體的旺盛生長，酶的大量合成則出現在易代謝碳源基本耗盡之後，且受到基質纖維素的誘導，常規PDA基質，到葡萄糖等易代謝碳源基本耗盡的後期，由於營養的缺乏，菌絲生理機能下降，酶的合成量減少。而木粒PDA不僅含有易代謝碳源——葡萄糖，又含有木粒這一緩效性營養，前期葡萄糖促進了菌絲體旺盛生長，獲取了大量的菌絲體，表現為菌絲粗壯、濃密。到了易代謝碳源耗盡的後期，木粒一方面補充了後期所需的營養，使菌絲的生埋機能維持在一定的水平；另一方面木粒的纖維素激活菌絲細胞纖維素酶的誘導機制，合成了大量的酶，保持了木腐生性灰樹花較強的分解木材的能力，因此，用該培養基培養的母種在轉接原種時適應力強，萌發定植快。因部分菌絲長入木粒內部，抵抗不良環境的生存能力增強，種質不易退化。木粒PDA灰樹花菌種，在0～5℃保藏2～3年再轉管活化，成活率仍達到90%左右。此外，木粒PDA應用於木腐性灰樹花種的提純復壯，效果也較理想。

（四）石蠟隔氧封藏 具體做法是將液態石蠟分裝入三角瓶內，裝量達瓶空間的1/3，塞好棉塞，於121℃滅菌2小時，然後置40℃溫箱中，使其水分蒸發，或置於乾燥器內數日以除去水分，石蠟呈透明狀為宜。在無菌條件下，用無菌吸管裝入已長好菌絲的斜面試管，使液面高出斜面頂部1厘米左右。塞上無菌橡皮塞，豎直保存。此法可使菌種存活3年以上，但以1～2年移植一次為好。移植時不必倒出石蠟，用接種鉤取一塊菌絲即可。因轉移時帶有石蠟，菌絲生長弱，需要再轉管1～2次，方能復壯。

Ⅶ 真菌一般的保藏方法有哪些，各自優缺點都是什麼

保存方法:

（1）室溫保存

（2）低溫保存

（3）礦物油下保存

（4）土壤中保存

（5）乾燥保存

（6）冷凍乾燥保存

（7）滅菌蒸餾水中保存

微生物具有容易變異的特性，因此，在保藏過程中，必須使微生物的代謝處於最不活躍或相對靜止的狀態，才能在一定的時間內使其不發生變異而又保持生活能力。

低溫、乾燥和隔絕空氣是使微生物代謝能力降低的重要因素，所以，菌種保藏方法雖多，但都是根據這三個因素而設計的。

保藏方法大致可分為以下幾種：

1．傳代培養保藏法

又有斜面培養、穿刺培養、皰肉培養基培養等（後者作保藏厭氧細菌用），培養後於4—6℃冰箱內保存。

2．液體石蠟覆蓋保藏法

是傳代培養的變相方法，能夠適當延長保藏時間，它是在斜面培養物和穿刺培養物上面覆蓋滅菌的液體石蠟，一方面可防止因培養基水分蒸發而引起菌種死亡，另一方面可阻止氧氣進入，以減弱代謝作用。

3．載體保藏法

是將微生物吸附在適當的載體，如土壤、沙子、硅膠、濾紙上，而後進行乾燥的保藏法，例如沙土保藏法和濾紙保藏法應用相當廣泛。

4．寄主保藏法

用於目前尚不能在人工培養基上生長的微生物，如病毒、立克次氏體、螺旋體等，它們必須在生活的動物、昆蟲、雞胚內感染並傳代，此法相當於一般微生物的傳代培養保藏法。病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法與冷凍乾燥保藏法進行保藏。

5．冷凍保藏法

可分低溫冰箱（-20—-30℃，-50—-80℃）、乾冰酒精快速凍結（約-70℃）和液氮（-196℃）等保藏法。

6．冷凍乾燥保藏法

先使微生物在極低溫度（-70℃左右）下快速冷凍，然後在減壓下利用升華現象除去水分（真空乾燥）。

有些方法如濾紙保藏法、液氮保藏法和冷凍乾燥保藏法等均需使用保護劑來制備細胞懸液，以防止因冷凍或水分不斷升華對細胞的損害。保護性溶質可通過氫和離子鍵對水和細胞所產生的親和力來穩定細胞成分的構型。保護劑有牛乳、血清、糖類、甘油、二甲亞碸等。

三、器材

細菌、酵母菌，放線菌和黴菌；

肉膏蛋白腖斜面培養基，滅菌脫脂牛乳，滅菌水，化學純的液體石蠟，甘油，五氧化二磷，河沙，瘦黃土或紅土，冰塊、食鹽，乾冰，95％酒精，10％鹽酸，無水氯化鈣；

滅菌吸管，滅菌滴管，滅菌培養皿，管形安瓿管，淚滴形安瓿管（長頸球形底），40目與 100目篩子，油紙，濾紙條（0．5×1．2cm），乾燥器，真空泵，真空壓力表，噴燈，L形五通管，冰箱，低溫冰箱（-30℃），液氮冷凍保藏器。

四、操作步驟、各保藏法的應用范圍及優缺點

下列各法可根據實驗室具體條件與需要選做。

1．斜面低溫保藏法

將菌種接種在適宜的固體斜面培養基上，待菌充分生長後，棉塞部分用油紙包紮好，移至2—8℃的冰箱中保藏。

保藏時間依微生物的種類而有不同，黴菌、放線菌及有芽孢的細菌保存2—4個月，移種一次。酵母菌兩個月，細菌最好每月移種一次。

此法為實驗室和工廠菌種室常用的保藏法，優點是操作簡單，使用方便，不需特殊設備，能隨時檢查所保藏的菌株是否死亡、變異與污染雜菌等。缺點是容易變異，因為培養基的物理、化學特性不是嚴格恆定的，屢次傳代會使微生物的代謝改變，而影響微生物的性狀；污染雜菌的機會亦較多。

2．液體石蠟保藏法

（1）將液體石蠟分裝於三角燒瓶內，塞上棉塞，並用牛皮紙包紮，1．05kg/cm2>，121．3℃滅菌30分鍾，然後放在40℃溫箱中，使水汽蒸發掉，備用。

（2）將需要保藏的菌種，在最適宜的斜面培養基中培養，使得到健壯的菌體或孢子。

（3）用滅菌吸管吸取滅菌的液體石蠟，注入已長好菌的斜面上，其用量以高出斜面頂端1cm為准（圖Ⅶ-12），使菌種與空氣隔絕。

（4）將試管直立，置低溫或室溫下保存（有的微生物在室溫下比冰箱中保存的時間還要長）。

此法實用而效果好。黴菌、放線菌、芽孢細菌可保藏2年以上不死，酵母菌可保藏1—2年，一般無芽孢細菌也可保藏1年左右，甚至用一般方法很難保藏的腦膜炎球菌，在37℃溫箱內，亦可保藏3個月之久。此法的優點是製作簡單，不需特殊設備，且不需經常移種。缺點是保存時必須直立放置，所佔位置較大，同時也不便攜帶。從液體石蠟下面取培養物移種後，接種環在火焰上燒灼時，培養物容易與殘留的液體石蠟一起飛濺，應特別注意。

3．濾紙保藏法

（1）將濾紙剪成0．5×1．2cm的小條，裝入0．6×8cm的安瓿管中，每管1—2張，塞以棉塞，1．05kg/cm2>，121．3℃滅菌30分鍾。

（2）將需要保存的菌種，在適宜的斜面培養基上培養，使充分生長。

（3）取滅菌脫脂牛乳1—2ml滴加在滅菌培養皿或試管內，取數環菌苔在牛乳內混勻，製成濃懸液。

（4）用滅菌鑷子自安瓿管取濾紙條浸入菌懸液內，使其吸飽，再放回至安瓿管中，塞上棉塞。

（5）將安瓿管放入內有五氧化二磷作吸水劑的乾燥器中，用真空泵抽氣至干。

（6）將棉花塞入管內，用火焰按圖Ⅶ-13熔封，保存於低溫下。

（7）需要使用菌種，復活培養時，可將安瓿管口在火焰上燒熱，滴一滴冷水在燒熱的部位，使玻璃破裂，再用鑷子敲掉口端的玻璃，待安瓿管開啟後，取出濾紙，放入液體培養基內，置溫箱中培養。

細菌、酵母菌、絲狀真菌均可用此法保藏，前兩者可保藏2年左右，有些絲狀真菌甚至可保藏14—17年之久。此法較液氮、冷凍乾燥法簡便，不需要特殊設備。

4．沙土保藏法

（1）取河沙加入10％稀鹽酸，加熱煮沸30分鍾，以去除其中的有機質。

（2）倒去酸水，用自來水沖洗至中性。

（3）烘乾，用40目篩子過篩，以去掉粗顆粒，備用。

（4）另取非耕作層的不含腐植質的瘦黃土或紅土，加自來水浸泡洗滌數次，直至中性。

（5）烘乾，碾碎，通過100目篩子過篩，以去除粗顆粒。

（6）按一份黃土、三份沙的比例（或根據需要而用其他比例，甚至可全部用沙或全部用土）摻合均勻，裝入10×100mm的小試管或安瓿管中，每管裝1g左右，塞上棉塞，進行滅菌，烘乾。

（7）抽樣進行無菌檢查，每10支沙土管抽一支，將沙土倒入肉湯培養基中，37℃培養48小時，若仍有雜菌，則需全部重新滅菌，再作無菌試驗，直至證明無菌，方可備用。

（8）選擇培養成熟的（一般指孢子層生長豐滿的，營養細胞用此法效果不好）優良菌種，以無菌水洗下，製成孢子懸液。

（9）於每支沙土管中加入約0．5ml（一般以剛剛使沙土潤濕為宜）孢子懸液，以接種針拌勻。

（10）放入真空乾燥器內，用真空泵抽干水分，抽干時間越短越好，務使在12小時內抽干。

（11）每10支抽取一支，用接種環取出少數沙粒，接種於斜面培養基上，進行培養，觀察生長情況和有無雜菌生長，如出現雜菌或菌落數很少或根本不長，則說明製作的沙土管有問題，尚須進一步抽樣檢查。

（12）若經檢查沒有問題，用火焰熔封管口，放冰箱或室內乾燥處保存。每半年檢查一次活力和雜菌情況。

（13）需要使用菌種，復活培養時，取沙土少許移入液體培養基內，置溫箱中培養。

此法多用於能產生孢子的微生物如黴菌、放線菌，因此在抗生素工業生產中應用最廣，效果亦好，可保存2年左右，但應用於營養細胞效果不佳。

5．液氮冷凍保藏法

（1）准備安瓿管用於液氮保藏的安瓿管，要求能耐受溫度突然變化而不致破裂，因此，需要採用硼硅酸鹽玻璃製造的安瓿管，安瓿管的大小通常使用75×10mm的，或能容1．2mm液體的。

（2）加保護劑與滅菌保存細菌、酵母菌或黴菌孢子等容易分散的細胞時，則將空安瓿管塞上棉塞，1．05kg/cm2，121．3℃滅菌15分鍾：若作保存黴菌菌絲體用則需在安瓿管內預先加入保護劑如10％的甘油蒸餾水溶液或10％二甲亞碸蒸餾水溶液，加入量以能浸沒以後加入的菌落圓塊為限，而後再用1．05kg/cm2>，121．3℃ 滅菌15分鍾。

（3）接入菌種將菌種用10％的甘油蒸餾水溶液製成菌懸液，裝入已滅菌的安瓿管；黴菌菌絲體則可用滅菌打孔器，從平板內切取菌落圓塊，放入含有保護劑的安瓿管內，然後用火焰熔封。浸入水中檢查有無漏洞。

（4）凍結再將已封口的安瓿管以每分鍾下降1℃的慢速凍結至-30℃。若細胞急劇冷凍，則在細胞內會形成冰的結晶，因而降低存活率。

（5）保藏經凍結至-30℃的安瓿管立即放入液氮冷凍保藏器（圖Ⅶ-14）的小圓筒內，然後再將小圓筒放入液氮保藏器內。液氮保藏器內的氣相為-150℃，液態氮內為-196℃。

（6）恢復培養保藏的菌種需要用時，將安瓿管取出，立即放入38—40℃的水浴中進行急劇解凍，直到全部融化為止。再打開安瓿管，將內容物移入適宜的培養基上培養。

此法除適宜於一般微生物的保藏外，對一些用冷凍乾燥法都難以保存的微生物如支原體、衣原體、氫細菌、難以形成孢子的黴菌、噬菌體及動物細胞均可長期保藏，而且性狀不變異。缺點是需要特殊設備。

6．冷凍乾燥保藏法

（1）准備安瓿管用於冷凍乾燥菌種保藏的安瓿管宜採用中性玻璃製造，形狀可用長頸球形底的，亦稱淚滴型安瓿管（圖Ⅶ-15），大小要求外徑6— 7．5mm，長105mm，球部直徑9—11mm，壁厚0．6—1．2mm。也可用沒有球部的管狀安瓿管。塞好棉塞，1．05kg/cm2>， 121．3℃滅菌30分鍾，備用。

（2）准備菌種，用冷凍乾燥法保藏的菌種，其保藏期可達數年至十數年，為了在許多年後不出差錯，故所用菌種要特別注意其純度，即不能有雜菌污染，然後在最適培養基中用最適溫度培養，使培養出良好的培養物。細菌和酵母的菌齡要求超過對數生長期，若用對數生長期的菌種進行保藏，其存活率反而降低。一般，細菌要求24—48小時的培養物；酵母需培養3天；形成孢子的微生物則宜保存孢子；放線菌與絲狀真菌則培養7—10天。

（3）制備菌懸液與分裝以細菌斜面為例，用脫脂牛乳2ml左右加入斜面試管中，製成濃菌液，每支安瓿管分裝0．2ml。

（4）冷凍冷凍乾燥器有成套的裝置出售，價值昂貴，此處介紹的是簡易方法與裝置，可達到同樣的目的。

將分裝好的安瓿管放低溫冰箱中冷凍，無低溫冰箱可用冷凍劑如乾冰（固體CO2>）酒精液或乾冰丙酮液，溫度可達-70℃。將安瓿管插入冷凍劑，只需冷凍4—5分鍾，即可使懸液結冰。

（5）真空乾燥為在真空乾燥時使樣品保持凍結狀態，需准備冷凍槽，槽內放碎冰塊與食鹽，混合均勻，可冷至-15℃。裝置儀器如圖Ⅶ-16，安瓿管放入冷凍槽中的乾燥瓶內。

抽氣一般若在30分鍾內能達到93．3Pa（0．7mmHg）真空度時，則乾燥物不致熔化，以後再繼續抽氣，幾小時內，肉眼可觀察到被乾燥物已趨乾燥，一般抽到真空度26．7Pa（0．2mmHg），保持壓力6—8小時即可。

（6）封口抽真空乾燥後，取出安瓿管，接在封口用的玻璃管上，可用L形五通管（圖Ⅶ-17）繼續抽氣，約10分鍾即可達到26．7Pa（0．2mmHg）。於真空狀態下，以煤氣噴燈的細火焰在安瓿管頸中央進行封口。封口以後，保存於冰箱或室溫暗處。

此法為菌種保藏方法中最有效的方法之一，對一般生活力強的微生物及其孢子以及無芽胞菌都適用，即使對一些很難保存的致病菌，如腦膜炎球菌與淋病球菌等亦能保存。適用於菌種長期保存，一般可保存數年至十餘年，但設備和操作都比較復雜。

Ⅷ 常用的蛹蟲草菌種保藏方法有哪些

在實踐中，人們嘗試了許多保藏方法，如繼代培養保藏法、液體石蠟保藏法、蒸餾水保藏法、冷凍乾燥保藏法。這些方法各有利弊，在實踐中要根據保藏的目的、資金及設備狀況等因素，選擇最佳保藏方法。

1.斜面培養基冰箱保藏法這是最常用的菌種保藏方法。因為它簡單易行，不需特殊設備，並能隨時觀察保藏菌種的情況。因此，短時間保藏菌種，一般都採用此法。

將需要保藏的菌種接種在斜面培養基上，在適宜的溫度下培養，當菌絲健壯地長滿斜面時，即可將此試管菌種取出，放在4℃的冰箱中保藏。用於保藏菌種的棉塞，要用硫酸紙包紮，防止黴菌污染。冰箱保藏蛹蟲草菌種，一般1個月轉管一次。

冰箱保藏，雖然簡單易行，但溫度不夠低，只有4℃左右，蛹蟲草的新陳代謝活動並未停止，而試管斜面也易失水變干。因此，保藏時間較短，1個月就需轉管一次，轉管次數多了，變異的可能性也就增大，不適宜長期保藏菌種。若保藏時間超過1月，菌種的轉色與出草能力明顯下降。

2.大米培養基冰箱保藏蛹蟲草在大米培養基上培養後在冰箱內能保藏較長的時間，根據試驗，保藏5個月菌種質量無明顯變化。

3.蠶蛹基質保藏法以家蠶蛹為培養基保藏蛹蟲草，在冰箱保藏4個月或在室溫下保藏1個月，均未發現明顯的變化，生產上多採用此種方法。

採用大米及家蠶蛹培養基在三角瓶保藏菌種，保藏的菌絲體相對較多，基質不易乾燥，生產上使用方便。

4.礦油保藏法礦油（主要是液體石蠟）保藏，也稱液體石蠟保藏。此法簡單易行，無需另添設備，各生產單位均可應用。礦油能隔絕氣體交流，防止培養基水分蒸發，抑制微生物代謝，推遲細胞衰老，能延長微生物的生命。

（1）培養基常用的培養基配方為20%的馬鈴薯汁500ml，5%的蠶蛹汁500ml，蛋白腖5g，磷酸二氫鉀（KH2PO4）3g，硫酸鎂（MgSO4H2O）1.5g，葡萄糖20g，維生素B1微量，瓊脂15g，pH6.5，1kg/cm2滅菌30min。

（2）礦油處理選用化學純的液體石蠟（要求不含水、不霉變、比重為0.865～0.890），分裝於三角瓶中，裝至瓶體的1/3處，塞好棉塞；另配一套具有虹吸管的橡皮塞，用紙包好，與三角瓶一起於1kg/cm2滅菌30min。滅菌後，將液體石蠟放在40℃的溫箱中，使液體石蠟中的水分蒸發干凈，至石蠟液呈完全透明為止。

（3）接種培養將需保藏的菌種，接入斜面培養基上，在20℃左右下培養，待斜面長滿健壯菌絲後，取出裝入礦油。

（4）礦油灌注將上述菌種和無菌礦油放入無菌室（箱），把有虹吸管的橡皮塞裝上礦油三角瓶，無菌操作使礦油注入斜面試管內（少量菌種也可用無菌吸管灌注），使液面高出斜面頂部1cm。

（5）菌種保藏將灌注礦油的試管直立放在試管架上，於室溫或冰箱中保藏均可。室溫保藏的環境應注意通風乾燥，以免棉塞發霉，並要定期檢查。如礦油覆蓋的斜面明顯變淺，應及時補充無菌礦油，切忌培養基露出液面。

液體石蠟易燃，使用時需加註意。從覆蓋礦油斜面中移植菌種時，應盡量少帶礦油。因礦油在火焰滅菌時，會爆炸飛濺。

以後用作菌種時，可從斜面上挑取少許培養基，接種在新鮮的培養基上，經過培養，即可使用。

5.雙重橡皮栓法用普通的斜面培養基先培養菌絲，用雙重橡皮栓取代棉塞。這種雙重橡皮栓要預先用氧化丙烯滅菌，方法是按1L容器注入1ml氧化丙烯，原封放置待用。採用蒸汽容易使橡皮變軟，而用氧化丙烯等滅菌方法可以避免此弊，利用雙重橡皮栓能防止空氣進入試管，從而達到與液體石蠟同樣的效果。

6.水箱中保藏法把蛹蟲草菌種懸浮在不含有機營養成分的水管中保存，一般用的懸浮液有蒸餾水、食鹽水、用蒸餾水時，在接有蛹蟲草菌種的瓊脂培養物中加入6～7ml蒸餾水，使細胞、孢子或蛹蟲草菌絲充分懸浮，爾後轉入試管內，密封後室溫下保藏。用食鹽水時，把在瓊脂培養基斜面上長好的菌絲懸浮在1%的食鹽水中，密封後在室溫條件下保存。

7.液氮超低溫保藏法此法是將菌種密封在含保護劑的安瓿管內，經控制速度凍結後，在－150～－196℃液態氮超低溫罐中保藏。

（1）菌種制備保藏孢子時，取孢子製成懸液，加入保護劑，裝入無菌安瓿管內。保藏菌絲體時，用液體振盪法培養菌絲球，或用平板培養菌絲體，也可用麥粒菌種。取適量放入無菌的裝有保護劑的安瓿管內。

（2）安瓿管製作安瓿管的玻璃，要能經受溫度突變而不破裂，容易用火焰封管口，恢復培養時容易打開。一般採用硼硅玻璃，管的大小根據需要而定，通常是75mm0mm或能容1.2ml液體的安瓿瓶比較合適。選好安瓿管後，每管加進0.8ml保護劑，塞上棉塞，1kg/cm2滅菌15min，作凍結瓊脂菌絲片或麥粒菌種用。如凍結孢子懸液時，則空管滅菌。

（3）保護劑用10%（體積比）甘油蒸餾水溶液或10%二甲亞碸（dimethylsulfoxide）蒸餾水溶液作保護劑。

（4）凍結保藏將上述准備好的菌種無菌操作移入加有保護劑的安瓿管中，用火焰將安瓿管上部熔封，浸在水中檢查有無漏氣。然後將封口的安瓿管放在慢速凍結器內，控制凍結速度（每分鍾下降1℃），使樣品逐步均勻地凍結到－35℃。－35℃以下的凍結速度，可不用控制而迅速下降。安瓿管凍結後，立即放入液氮罐中。罐內的氣相溫度為－150℃，液體溫度－196℃。

（5）恢復培養保藏菌種時，將安瓿管從液氮罐中取出，立即放入38～40℃的水中搖盪至管內凍結物全部融解，開啟安瓿管，將管內菌種接入適宜培養基培養即可。

液氮超低溫保藏，是目前長期保藏菌種的最好的一種方法。用它進行保藏各類微生物和活細胞的試驗，都獲得了滿意的結果。對那些難以保藏的或只產生菌絲的真菌，用此法保藏也很成功。

現在，普遍對液氮保藏的效果都持樂觀態度，認為液氮保種很少或不會引起細胞中遺傳物質的變化。而且液氮保藏後菌株出現的問題卻很少報道。然而，Fritss首先在荷蘭Horst發現雜交菌株U1經液氮保藏3年後出現退化，部分培養物產量下降，出現硬開傘，經組織分離培養後，產量質量又恢復正常。據她認為，經原生質體重新融合產生的雜交菌株，其本身對不利因素（如超低溫的刺激）適應性差，故在液氮保藏中必須考慮到這一影響。而且反復的冷凍和解凍也會使菌株受到不同程度的損傷。

另一方面，液氮保藏本身也有不足之處，問題在於液氮保藏系統成本高，有些地方液氮不足，使一般保藏中心不能單獨依靠這一保藏技術。而且液氮保藏的菌種，首先必須培養在瓊脂培養基或液體培養基中，對郵寄交流造成一定麻煩。

一般認為，在未經有效可靠檢測之前，從液氮保藏中取出的菌種尤其是雜交菌株，不宜作當年產季的生產用種，必須經過出菇試驗，以確保無退化或無變異才能投入生產。

乾燥保藏的作用原理在於除去蛹蟲草菌絲細胞的游離水，以達到除去細胞代謝的液相環境，從而使代謝活動停滯並進入休眠狀態，有利於長期保存。