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生物素標記抗體用什麼顯色呢

發布時間:2022-07-02 19:36:40

㈠ 酶聯免疫檢測的方法及原理是什麼

(1)酶聯免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA):是將抗原或抗體吸附在固相載體表面。使抗原抗體反應在固相載體表面進行。可用間接法、雙抗體夾心法或競爭法測定抗原或抗體。
(2)夾心法(sandwich assay):將已知的特異抗體包裝在固相載體(塑料板凹孔或紙片上),加入待檢標本,標本中的抗原即可與載體上的抗原結合,洗去未結合的材料後加入該抗原的酶標記抗體,洗去未結合的酶標抗體,加底物顯色,用酶免疫檢測儀測量顏色的光密度,可定量測定抗原。
間接法(indirecr ELISA)常用於檢查特異抗體。先將已知特異抗原包被固相載體,加入待檢標本(可能含有相應抗體),再加入酶標抗Ig的抗全(即第二抗體),經加底物顯色後,根據顏色的光密度計算出標本中抗體的含量。
(3)BAS-ELISA:近年來對酶免設分析法的改進是使用生物素-親合素-過氧化物酶復合物作為指示劑,組成一新的生物放大系統進一步提高檢測的敏感度。可用來檢測多種抗原抗體系統如細菌、病毒、腫瘤細胞表面抗原等。一個親合素(avidin)分子可以結合4個生物素分子(biotin)。結合非常穩定。親合素和生物素都可與抗全、酶、熒光素等分子結合,而不影響後者的生物活性。一個抗體分子可偶聯90個生物素分子,通過生物素又可連接多個親合素。因此大提高檢測的敏感度。目前應用生物-酶標親合素系統(biotinavidin system- ELISA,BAS-ELISA),它是通過生物素標記抗體連接免疫反應系統,同時藉助生物素化酶或酶標親合素引入酶與底物反應系統。

㈡ elisa 生物素標記多克隆抗體還是單克隆抗體較好

其實生物素只是充當一種顯色的介質,和親和素具有較強的親和力,看你檢測體系是需要用多克隆和單克隆吧,應該沒多大區別

㈢ 生物素標記的抗體 選用哪種免疫組化染色

標記親合素-生物素法(LAB法)

㈣ 為什麼免疫組化染色ABC法比SP法更靈敏

可以看下面這個示意圖:

如果沒有生物素,鏈霉親和素上帶有的HRP酶是有限的,因為兩個蛋白都有一定的空間結構,空間位阻可能會導致蛋白的某些生物學功能喪失,所以鏈霉親和素能夠偶聯上的HRP數量受限。但是如果用生物素標記HRP,再把生物素-HRP與鏈霉親和素一起孵育,這個時候是兩個蛋白被生物素這個小分子連接,一個鏈霉親和素可以和4個生物素結合,假設完全理想的狀態,二抗的生物素佔去一個位點,還有3個位點可以結合帶有生物素的HRP,也就是變成了一分子鏈霉親和素帶有3分子的HRP,酶量增加了,當然靈敏度也就相應的提高了。

㈤ 如何用生物素標記抗體

緩沖溶液的作用主要就是pH穩定性和離子強度的適合,還有避免緩沖溶液中的成分與樣品分子發生共價鏈接,主要就是考慮這些。
鏈接很容易,就用EDC或者CMC等碳二亞胺,是最容易在羧基和氨基之間催化形成醯胺鍵,反應條件就是0到4度,過夜,用磁力攪拌子溫和攪拌,pH<7反應快,不過pH=7或稍微pH>7也關系不大。EDC或者CMC等碳二亞胺催化活性極高,而且一般的蛋白質的分子表面總有Lys,Arg,Asn,Gln,所以游離在分子表面的羧基和氨基總是不少的,參與反應的兩種蛋白質用大致10:1的比例混合(哪種蛋白質便宜,哪種蛋白質的物質的量就大些,但是這不是全部原因),反應樣品濃度就按照平時使用時的濃度或略微更低濃度(別用儲存液的濃度)即可。很容易反應,而且EDC或者CMC等碳二亞胺是零臂連接試劑,用於空間位阻,形成多分子交聯可能較小,即使形成了也很容易用分子篩層析按照分子量區分開。
參與反應的兩種蛋白質用大致10:1的比例混合(哪種蛋白質便宜,哪種蛋白質的物質的量就大些,但是這不是全部原因),為了避免兩種蛋白質之間發生交聯成為串聯,因為一種蛋白質形成串聯的可能性低一些;即使要形成串聯的蛋白質串珠,最好也不要是價格高的那種;另外,EDC或者CMC等碳二亞胺催化活性極高,室溫下即會催化,所以要在0到4度,過夜,用磁力攪拌子溫和攪拌,一方面避免碳二亞胺催化活性太高形成串聯的蛋白質串珠,另一方面,保護蛋白質不變性;反應樣品濃度就按照平時使用時的濃度或略微更低濃度(別用儲存液的濃度)即可,為什麼?因為濃度高了更易形成串聯的蛋白質串珠結構,濃度低了,沒有反應成功,通過分子篩層析還可以分離出來接著連接,如果形成了醯胺鍵再要專一性切開就沒有那麼容易了。

㈥ 過生物素標記的流式抗體及鏈霉親和素標記的熒光素嗎

過生物素標記的流式抗體及鏈霉親和素標記的熒光素
抽血檢測,一般用三代酶聯合免疫法 酶聯免疫法,簡稱ELISA。 它的中心就是讓抗體與酶復合物結合,然後通過顯色來檢測。 步驟:ELISA用血清來檢測,首先血液要經過至少半個小時的凝集,然後取血清(這是有些網友不理解為什麼醫院抽完了血對血置之不理的原因,其實是誤會)。將酶復合物用稀釋液稀釋後,加血清及陰性、陽性對照,還有就是質控品(這是嚴格的要求,它的范圍必須在質控范圍內)。經過一個小時的孵育,然後洗板,加底物,半個小時避光反應後加終止液即完成反應部分,然後就是讀數。由數值來判斷結果的陰性或陽性。嚴格的講,如果第一次檢測為陽性的話,無論是哪個實驗室,必須按照CDC的HIV操作規程來進行第二次檢測,第二次的方法必須與第一次的不同,如還是陽性,將送確認實驗室確認。有的醫院很不負責,將初篩陽性的報告發出後就不管了,這是不對的。必須經過確認實驗室確認後才可出陽性診斷。祝大家。PS,第一次檢測為陽性的話,一定要去確認實驗室再做一次,勇敢的去面對,也許結果就不一樣了。 基本原理是:使抗原或抗體結合到某種固相載體表面,並保持其免疫活性。

㈦ 熒光二抗標記用HRP、AP、FITC、生物素法各發什麼顏色熒光

這四個不是一碼事,HRP和AP是酶,二抗上掛了酶,要給相應的底物才能顯色,顯色方式可以通過發熒光也可以不發熒光(例如給予ECL底物,其中的H2O2和魯米諾在HRP的作用下,能在黑暗中發出熒光;也可以給予雙氧水和DAB,反應產生棕色不溶於水的物質);FITC為異硫氰酸熒光素,本身就是黃綠色熒光,二抗結合後可直接在熒光顯微鏡下觀察;生物素一般也是掛在二抗上的,利用卵白素分別連接生物素標記的第二抗體和生物標記的酶,由酶催化底物,生成終產物,這個終產物也是不溶於水的。

㈧ 免疫組化一抗+生物素化的二抗+DAB顯色,這屬於什麼方法

SP,但其實和ABC基本原理是一樣的,生物素化的二抗孵育之後還需要一步是用HRP(或者其他酶類)標記的鏈霉卵白素復合物孵育使其與生物素結合,然後和DAB反應的是HRP。簡單來說就是:一抗--生物素化二抗結合一抗種屬IgG--帶HRP鏈霉卵白素結合生物素--DAB與HRP反應顯色。

㈨ 蛋白marker為什麼能作為顯色條帶

蛋白marker可分為:一、未預染的Marker即寬分子量蛋白標准、高分子量蛋白標准以及低分子量蛋白標准;二、預染的Marker即單色預染和多色預染。

在western Blot過程中,分子量Marker就像個螺絲釘一樣沒雖然是個小細節,然而就是這樣一個小細節對實驗結果有著不可忽視的作用。這個 Western Blot參照家族的一員的作用主要是用來指示蛋白條帶所對應的分子量大小,只有標准量精確無誤了,實驗結果才有說服力,除此之外,蛋白標准還有表示轉移成功或者蛋白在凝膠上的電泳程度等等的作用,所以選擇正確的蛋白Marker也是western blot實驗成功的必要條件之一。

總體來說,蛋白分子量標准可以分成未染蛋白分子量標准、預染蛋白分子量標准二個級別。以下是關於蛋白分子量標準的小敘:

一. 未染色(pre mixed)蛋白分子量標准

未染色的蛋白分子量標準是最簡單,也是最准確的一種。由於沒有附帶染料分子或者是標記分子,所示大小正好是蛋白原本的大小,是精確判斷蛋白大小必須的。現在的marker多數都選用預混和的Marker,方便不同大小的蛋白比較。預混的Marker通常有幾條帶加倍濃度作為指示,因為混合的條帶越多,越不好記,誰知道哪條是那條!數到眼都花了。所以當看到特別濃的那幾條標志帶就記得是哪裡了。不過要記得,小帶通常都不那麼容易看清楚的。在選擇上來說,當然是選擇其中至少有一條條帶和自己的目的蛋白大小相近的最好,越近越好。如果你的蛋白不幸在兩條跨度較大Marker條帶之間,選別的Marker吧。預混的Marker使用上不如預染Marker(pre-stained)好用,因為電泳過程中完全看不到,要和目標蛋白一起等到最後染色才「開蠱」,無法對實驗起預示參照作用。完全屬於「後知後覺」型的,當然還是比「不知不覺」不做對照的要好。

① 寬分子量蛋白標准

如果從實驗室總體考慮的,就選范圍盡量寬,條帶分布比較均勻的,這樣你的蛋白無論在哪個區間都容易判斷,避免正好落在一段空白區的危險。不過條帶越多,每次上樣量也就越費。拿到Marker後,如果買的是大包裝,就應該考慮分裝。多次反復凍融對於蛋白的危險,不用多說吧。另外要記得,寬譜的Marker不一定每條都能看到的,特別是Mini Cell。如果側重大蛋白,那小的可能就已經跑掉了,不是質量不好哦。

② 高分子量蛋白標准

通常在檢測大分子量蛋白經常使用到高分子量蛋白標准,

③ 低分子量蛋白標准

在一般的蛋白電泳當中,更常用的是低蛋白標準分子量,除了有指示蛋白大小的作用以外,有時還可以用作粗略的定量。實驗室用在一般蛋白電泳的低分子量蛋白標准中。

在低分子量蛋白標准這里還包括可特別小的蛋白標准,比如30kD以下蛋白或者多肽的分離辨別。其中GE的從2kD到16kD之間有6條帶的蛋白標准挺不錯,另外提醒一句,特別小的蛋白Marker條帶如果要顯色好,上樣一定要上足夠的量哦。

二.預染蛋白分子量標准

預染蛋白分子量是一些純化好的蛋白混合物,通過與染料共價耦聯,在電泳過程中或者轉膜時可以直接觀察到。預染蛋白分子量的出現方便了我們的實驗,這種蛋白分子量標准可以幫助我們在電泳時、電泳後,以及轉膜後監測電泳情況和估計遷移率——比如,已知垂直電泳最佳分辨區域大約在膠的2/3處,如果使用預染Marker就可以預測目標蛋白進入最佳分辨區時停止電泳以得到最佳分辨效果;如果觀察到Marker電泳異常也可以及時終止電泳;另外在Western Blot轉膜以後可以直接觀察蛋白轉膜是否完全,還可以在膜上標記蛋白分子量,所以吸引了許多實驗室人員購買預染蛋白標准。值得注意的是預染蛋白Marker與染料共價耦聯,所以在不同的緩沖條件下電泳時遷移特性可能會發生某些變化,可能導致一些偏差,所以不太適合精確定位蛋白——不過多數情況下Marker的條帶未必能和我們的目標蛋白完全一樣,我們得到的也不過是一種相對Marker指示的參考大小,最後都需要Western來定性,所以如果不是要區分大小相近的條帶,預染Marker還是很好用的,而且也可以和未染色的蛋白標准一起使用。

預染蛋白標准可以分為兩種:單色預染和多色預染,其實區別就在於幫助在實驗過程中辨認某個條帶的大小——Marker條帶越多參考價值越大,可就越難辨認區分,如果用不同的顏色來區別就比較好辨認啦。如果沉悶的電泳實驗中跑出五顏六色的彩虹Marker,此時心情想必會愉快一些!單色的Marker通常是利用其中某些條帶加倍濃度來提示其大小的。還有一點特別要注意,由於轉膜是一個將膠里的Marker濃縮在潔白的膜上,所以需要的上樣量相對少一些,如果想要在電泳過程中看到美麗的「彩虹」,或者單色的Marker往往需要比說明書里多加一些Marker的。

三、Western專用的蛋白分子量標准

①生物素標記蛋白標准

未染色的Marker在做Western時,需要在印跡前先用麗春紅或者是SYPRO熒光蛋白染色液等不幹擾Western Blot的染色方法顯色,在膠上做標記最後才能「拼」在最後的結果中,如果是預染的Marker就要在轉膜後標記膜,或者剪膜,最後在「拼上」。要是想直接將Marker結果顯示在最後結果上,不用手工作圖或者拼接,那就要Western專用的Marker了。比如生物素標記的蛋白標准。這種方法主要是配合化學發光法:在蛋白分子量上標記生物素,通過帶有抗生物素的抗體或者偶聯鏈親黴素的抗體,在化學發光檢測到目的蛋白帶時就可以同時看到相應的分子量標准一起發光顯影了。不同於普通蛋白分子量標準的便宜、預染蛋白分子量的方便,這一方法的優點是與Marker和目的蛋白對應性好,同時在同張片上顯示,不用拼接,利於分析。缺點是如果樣品中帶有生物素背景,那個抗生物素抗體有可能影響結果,而且反應體系太過復雜也會干擾實驗結果。

②特殊標記蛋白標准

在經過修飾的蛋白標准中,除了生物素標記以外,近些年由於下游蛋白操作的豐富化與復雜化,也出現帶有「尾巴」的蛋白標准。比如His-Tag,如果每個Marker條帶都有His –tag,那二抗添加His-Taq抗體很容易將Marker條帶顯示在Western結果上。很方便,問題就是有可能有潛在的干擾,比如樣品中正好有類似Histag的結構。不過這可以通過對照檢測的。

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