免疫細胞化學照片怎麼拍

① 免疫細胞化學技術的標本的制備

· 標本制備恰當，是免疫組化成功的首要條件
· 免疫組化對組織和細胞標本的要求
– 保持所檢標本原有的結構、形態；
– 在原位最大程度地保持待測抗原(或抗體)的免疫活性，既不淬滅、流失或彌散，也不被隱蔽。
· 免疫組化的組織和細胞標本，製作流程與常規處理方法基本相同，但對組織、細胞的處理又有其特殊要求及注意事項。
– 各種抗原由於其含量及特性的差異對標本處理方式常有不同要求，因此要選擇適用於本實驗的最佳方法。
免疫組化中常用的組織和細胞標本
· 組織標本
– 石蠟切片
– 冰凍切片
· 細胞標本
– 組織印片
– 細胞培養片(細胞爬片)
– 細胞塗片 · 石蠟切片是製作組織標本最常用、最基本的方法
– 最大優點是組織形態保存好，且能作連續切片，有利於各種染色對照觀察；
– 石蠟塊還能長期存檔，供回顧研究。
· 石蠟切片製作過程對組織內抗原顯現有一定的影響，但可通過某些措施予以改善，因而它是大多數免疫組化中首選的組織標本製作方法。
1、取材的特殊要求及注意事項
· 標本新鮮：一般在2h以內進行，超過2h，組織將有不同程度的自溶，其抗原或變性消失，或嚴重彌散。
· 取材部位：除取病灶或含待檢抗原部位外，還應取病灶與正常交界處，即所取組織切片中同時應有抗原陽性和陰性區，以形成自身對照。
– 細胞壞死後，不僅抗原彌散或消失，而且常引起非特異著色，干擾觀察，因此取材時應盡可能避開壞死區。
1、取材的特殊要求及注意事項(續)
· 避免擠壓：取材時組織受擠壓可使邊緣部細胞形態改變並加深非特異著色，因而取材時應使用鋒利的刀刃；
– 鑷取組織動作要輕；
– 經窺鏡直接鉗取的組織往往有過度擠壓，觀察結果時應有所考慮。
2、固定及常用的固定液
· 取材後的組織需立刻投於固定劑中
– 固定使組織和細胞的蛋白質凝固，終止內源性或外源性酶反應，防止組織自溶或異溶，以保持原有結構和形態；
– 對免疫組化而言更有原位保存抗原的作用，避免抗原失活或彌散。
· 常用固定液：固定劑品種很多，但大多屬於醛類和醇類。其固定原理不同，各有優缺點。
– 醛類（常用甲醛、戊二醛和多聚甲醛）
– 醇類（常用乙醇）
– 其它 （丙酮）
(1) 醛類
· 甲醛(福爾馬林)應用最廣
– 原理：形成分子間的交聯，影響蛋白構型而使之固定。
– 優點：形態結構保存好，且穿透性強，組織收縮少。
– 缺點：
· 甲醛放置過久可氧化為甲酸，使溶液pH降低，影響染色；
· 醛基與抗原蛋白的氨基交聯形成羧甲基，使抗原決定簇的三維構象出現空間障礙；
· 分子間交聯形成的網格結構可能部分或完全掩蓋某些抗原決定簇，使之不能充分暴露。可造成假陰性的染色結果。
– 注意事項：
· 縮短固定時間，降低固定溫度(4C)，為此組織塊不宜過厚。
· 改用中性緩沖福爾馬林，以pH值7.2～7.4 0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液配製成10%甲醛固定液，減少固定液pH的變化。
· 固定後充分水洗以減少分子間交聯。
· 切片在作免疫組化染色前，先經預處理使抗原再現(抗原修復)。
· 戊二醛：
– 穿透性強，微細結構保存好，但對抗原有一定影響，常與其他固定劑聯合用作免疫電鏡固定液。
· 多聚甲醛(常用4%)：
– 可用於免疫電鏡；也可用於免疫熒光染色。
· 主要檢測組織內一些性能嬌弱的抗原特別是細胞表面抗原，例如各類淋巴細胸分化決定簇(CD)、主要組織相容性抗原等。
(2) 醇類
· 最常用的醇類固定劑是乙醇。
– 其固定作用：使細胞內蛋白、糖類發生沉澱。
– 優點：穿透性強、抗原性保存好。
– 缺點：
· 脫水性強，易引起組織收縮、變硬，影響切片質量，因而乙醇固定時間不宜過長(2h內)。
· 乙醇使蛋白變性的作用輕，固定後可再溶解；染色過程中，溫育時間長，抗原可流失而減弱反應強度。
(3) 其它固定劑
· 丙酮：
– 對抗原性的保存好，但脫水性更強，較少 用於組織標本，但細胞爬片常用丙酮固定。
3、抗原修復——原因
· 常規的石蠟切片標本均用甲醛固定，結果使得：
– 抗原性物質形成醛鍵、羧甲鍵而被封閉了部分抗原決定簇；
– 蛋白之間發生交聯而使抗原決定簇隱蔽。
· 要求：在染色時，需要先進行抗原修復或暴露，即將固定時分子之間所形成的交聯破壞，而恢復抗原的原有空間形態。
3、抗原修復——方法
· 化學方法
· 加熱方法
– 水浴加熱法
– 微波照射法
– 高壓加熱法
– 酸水解法
(1) 化學方法
· 主要是通過一些酶的作用，使抗原決定簇暴露。常用的酶有：胰蛋白酶、胃蛋白酶等。
– 胰蛋白酶：一般使用濃度為0.05%～0.1%，消化時間為37C，10～40min，主要用於細胞內抗原的顯示；
– 胃蛋白酶：一般使用濃度為0.1%～0.4%，消化時間為37C、30～180min，主要用於細胞間質抗原的顯示。
· 例如：Laminin、CollagenIV
(2) 水浴加熱法
· 將玻片放入裝有抗原修復液的容器中，加熱至沸騰，持續10～15分鍾。
– 優點：操作簡單、經濟，適用於所有的實驗室，
– 缺點：對封閉牢固的抗原決定簇暴露不理想。
(3) 微波照射法
· 將玻片放入裝有抗原修復液的容器中，置微波爐加熱至95℃以上，持續l0～15分鍾，冷卻後，按免疫組化染色步驟進行。
· 此方法由於微波場內極性分子、離子高速運動，撞擊交聯的網鏈，使抗原異常的構想恢復正常，且因分子運動產熱、效率高、時間短，對抗原再現效果好。
(4) 高壓加熱法暴露抗原
· 將玻片浸入抗原修復液內，置高壓鍋中高壓2～3min，可取得極好的效果。
· 由於高壓下受熱均勻，特別使用於大批量標本的染色。
(1) 酸水解法
· 酸水解可使交聯斷裂、暴露抗原。
· 將玻片浸入1mol/L HCl 溶液中，室溫作用20min(溫度升高，作用時間縮短)。
· 此法能增強特異性染色，降低背景，但需注意水解過度將破壞抗原性及形態結構。
加熱法的注意事項
· 達到規定的溫度(92～95C以上)；
· 維持一定的時間；
· 避免切片乾涸 (抗原可能完全丟失)；
· 加熱後必須經過室溫自然冷卻20～30分鍾，使未折疊的蛋白分子鏈恢復天然構型；
· 修復液：
– 最常用的是pH6.0的0.01mol/L的枸櫞酸鹽緩沖液；
– 最新研究表明鹼性修復液更有效，推薦使用1mM的EDTA緩沖液(pH8.0)。
4、載玻片的處理
· 抗原修復過程中，由於高溫、高壓等諸多固素的影響，極易造成脫片。為防止脫片，常用粘附劑處理載玻片。
– 新載玻片上有油污，要用洗液浸泡12～24h，自來水沖洗後再用蒸餾水清洗；用綢布擦乾或烤箱烤乾。清潔的載玻片再用粘附劑處理。
· 常用的粘附劑有：
– APES（3-氨丙基三乙氧基硅烷）
– Polv-L-Lysine（多聚賴氨酸）
– 鉻明膠溶液
APES(3-aminopropyltriethoxysilane)
3-氨丙基三乙氧基硅烷
· 現用現配。用純丙酮或甲醇配製2%APES(v/v);
· 將洗凈的玻片浸於此液中20～30秒鍾；
· 取出稍停片刻，再入純丙酮酮溶液洗去未結合的APES，置通風櫥中晾乾或60C烤箱烤乾。
Polv-L-Lysine (多聚賴氨酸)
· 將清潔玻片浸於100g/ml(10%w/v)的多聚賴氨酸溶液中(去離子水稀釋)，37C放置30min，然後60C烤箱烘烤1h或室溫過夜乾燥。裝盒備用。
鉻明膠溶液
· 試劑：鉻明礬(chrome alum) 0.25g
明膠(gelatine) 2.5g
蒸餾水 500ml
· 先將鉻明礬溶解於40C少量蒸餾水中，再加入明膠及蒸餾水，可在70 C水浴中使明膠溶化，攪拌均勻後，即可使用。如有殘渣，可過濾後再用。
· 用時稍加溶化，切片浸入2～3min，過夜晾乾。 · 冰凍切片是指將組織在冷凍狀態下直接切片。
· 在切片前組織不經過任何化學葯品處理或加熱過程。
– 縮短了製片時間
– 抗原性不受損失
· 對穩定性差的抗原，如淋巴細胞表面抗原尤其適合。
· 組織凍結過程中，細胞內、外的水分會形成冰晶，凍結的速度愈慢，冰晶顆粒愈大，可嚴重影響組織、細胞的形態結構。因此制備凍塊時要求低溫、速凍。
1、冰凍組織塊的常用方法
· 液氮中冰凍：組織投入液氮中 (一196C)中10～20sec；
· 乾冰中加入丙酮(或異戊烷)，液體立即氣化起泡，溫度降至一70C ，將組織投入，若在乾冰丙酮中置一盛有異戊烷的容器，組織投入該容器內結凍則更好；
– 上述組織在速凍時應浸埋於OCT包埋劑或甲基纖維素糊狀液內，以保護組織。
– 製成凍塊後若需保存，應以鋁箔或塑料薄膜封包，貯存於-70 C冰箱。
2、切片
· 供免疫組化用的冰凍切片同樣要求附貼平整，並有連續性。
· 載玻片也應清潔無油污，但一般無需塗抹粘附劑；
· 切片時，使用恆溫冷凍切片機，在箱內溫度-25 C 。切片厚度一般為4～8m。
3、切片後處理
· 切好的冰凍切片，室溫下自然晾乾1～2h後，入4C丙酮固定10min，待乾燥後作免疫組化染色或封存於-20℃。
· 冰凍切片由於切片技術要求較高，不易得到連續性很好的切片，其形態結構亦不如石蠟片，且凍塊和切片不便於長期貯存，因此冰凍切片的應用受限。 · 貼壁細胞培養時，置蓋片於培養瓶中，使細胞在蓋片上生長，達適當密度後取出固定(丙酮-20C固定10～20min)，再進行免疫染色。
– 蓋片的處理方法同載玻片的處理，但泡酸時間2h即可。
– 為了防止細胞脫片，可用多聚賴氨酸處理。 · 大多數細胞塗片由細胞懸液製成，包括：
– 血液、尿液、腦脊液；
– 體腔積液；
– 組織穿刺吸取，如骨髓、淋巴結或其他實質性組織
– 懸浮培養的細胞或貼壁細胞經消化後形成的懸液。 · 細胞塗片的方法：
– 手塗法
· 將細胞濃度調節到106/ml左右，可直接塗於載玻片上，但要均勻、不重疊。
· 圖片范圍應小於1cm直徑，以節約試劑。
– 塗片機塗片法
· 將細胞樣品製成2×105～6/ml 細胞懸液，吸取50～100l (1～2×104～5cells) 加入塗片機內，1000rpm離心2min後細胞就均勻分布於玻片上。

② 如何做好免疫細胞化學實驗

載玻片/蓋玻片處理

聚醚醯亞胺或多聚賴氨酸在室溫下包被蓋玻片1小時。

無菌水沖洗蓋玻片（3次 ，每次5分鍾）。

可將蓋玻片幹完全乾燥，並在紫外光下消毒至少4小時。

在玻片上種植細胞，或准備細胞離心塗片器，或做好塗抹准備。

磷酸鹽緩沖液（ PBS ）進行簡短的沖洗。

第一步：細胞固定

用預冷的甲醇、丙酮（ 1-10分鍾），或3-4 ％甲醛（PBS的pH值7.4）室溫（或者-20 ℃)固定細胞片15分鍾。

用預冷的PBS沖洗細胞片兩次。透化：如果目的蛋白是胞內表達，透化細胞非常重要。註：丙酮固定標本不需要透化。

用含0.25% Triton X-100或100 μM 洋地黃皂苷 or 0.5% 皂苷的PBS室溫孵育標本10分鍾。Triton X - 100是目前最流行的通透劑，可提高抗體的滲透程度。但這不適合與膜相連抗原的使用，因為它會將膜破壞。

PBS清洗細胞片3次，每次5分鍾。

第二步：封閉和孵育

PBST孵育細胞（1 ％牛血清白蛋白），室溫30分鍾，以封閉抗體非特異性結合位點（封閉液也可以是1 ％明膠或10 ％的血清，此血清需來自二抗產生的物種體內） 。

加入一抗在濕盒內孵育細胞片（在使用含1% BSA PBST稀釋抗體的），室溫1小時或4 ℃過夜。

緩慢倒出溶液，PBS清洗細胞片的3次，每次5分鍾。

加入含1 ％BSA的二抗稀釋液，室溫避光孵育1小時（避光）。

緩慢倒出二抗溶液，PBS清洗3次，每次5分鍾（避光）。

第三步：復染

在0.1-1 μg/ml Hoechst or DAPI (DNA染液)下孵育細胞1分鍾。

PBS清洗。

第四步：封片和觀察

滴加一滴封片劑封片劑質，蓋上蓋玻片。

用指甲油密封蓋玻片，以防止乾燥和顯微鏡觀察時移動。

觀察後的細胞片可避光保存在-20或4°C。

③ 免疫熒光圖片中的Lu,m,ad分別是指什麼

免疫熒光測定

抗原抗體反應後，利用特殊儀器測定熒光強度而推算被測物濃度的檢測方法

⑴熒光物質

1）熒光色素

許多物質都可產生熒光現象，但並非都可用作熒光色素。只有那些能產生明顯的熒光並能作為染料使用的有機化合物才能稱為免疫熒光色素或熒光染料。常用的熒光色素有：

⑴異硫氰酸熒光素（fluoresceinisothiocyanate，FITC）為黃色或橙黃色結晶粉末，易溶於水或酒精等溶劑。分子量為389.4，最大吸收光波長為490--495nm，最大發射光波長520--530nm，呈現明亮的黃綠色熒光，結構式如下：

有兩種同分異結構，其中異構體Ⅰ型在效率、穩定性、與蛋白質結合能力等方面都更好，在冷暗乾燥處可保存多年，是應用最廣泛的熒光素。其主要優點是：①人眼對黃綠色較為敏感，②通常切片標本中的綠色熒光少於紅色。

⑵四乙基羅丹明（rhodamine，RIB200）為橘紅色粉末，不溶於水，易溶於酒精和丙酮。性質穩定，可長期保存。結構式如下：

最大吸收光波長為570nm，最大發射光波長為595～600nm，呈橘紅色熒光。

⑶四甲基異硫氰酸羅丹明（，TRITC）結構式如下：

最大吸引光波長為550nm，最大發射光波長為620nm，呈橙紅色熒光。與FITC的翠綠色熒光對比鮮明，可配合用於雙重標記或對比染色。其異硫氰基可與蛋白質結合，但熒光效率較低。

⑵其他熒光物質

④ 免疫細胞化學染色SP法的步驟，誰能給傳一下，我要自己做，謝謝，還不知怎麼做呢

換個播放器試試，應該是播放器被掛了碼。如果還是同樣的問題，那就是顯卡有問題，升級驅動，還不能解決，就要換顯卡了。

⑤ 求 少突膠質細胞 免疫細胞化學 圖片

我找到幾張

⑥ 免疫組化照片怎樣剪裁，就是發表文章時，怎樣處理自己拍下來的免疫組化照片

一切以能客觀展示你的實驗結果為基礎，有的科研工作者採用局部放大，疊加照片(整體照片放大倍數正常，局部照片放大倍數高)的形式進行展示，也是一個不錯的展示方法。

下圖是義翹的典型IHC結果，可以作為參考。祝順利

⑦ 請教免疫熒光顯微鏡拍照的問題：怎樣做才可以拍攝出高清晰照片

熒光顯微鏡下你人眼是不是觀察清楚了，是不是在暗室內觀察拍照的，熒光光源是紫外光，要求在暗室內關燈觀察拍照。如果目視下觀察清楚的話，還拍不清，那你要考慮攝像頭了，建議攝像頭採用製冷 的，晶元採用CCD而不是CMOS的。本來熒光對攝像頭的要求就很高，如果不採用專用的熒光製冷CCD的話效果肯定不會好的。一套國產熒光製冷CCD售價在8000元左右，四五千的就不建議了，參數大於形式。希望對你有幫助，還有要了解的請追問