生物素标记抗体用什么显色呢

㈠ 酶联免疫检测的方法及原理是什么

（1）酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）：是将抗原或抗体吸附在固相载体表面。使抗原抗体反应在固相载体表面进行。可用间接法、双抗体夹心法或竞争法测定抗原或抗体。
（2）夹心法（sandwich assay）:将已知的特异抗体包装在固相载体（塑料板凹孔或纸片上），加入待检标本，标本中的抗原即可与载体上的抗原结合，洗去未结合的材料后加入该抗原的酶标记抗体，洗去未结合的酶标抗体，加底物显色，用酶免疫检测仪测量颜色的光密度，可定量测定抗原。
间接法（indirecr ELISA）常用于检查特异抗体。先将已知特异抗原包被固相载体，加入待检标本（可能含有相应抗体），再加入酶标抗Ig的抗全（即第二抗体），经加底物显色后，根据颜色的光密度计算出标本中抗体的含量。
（3）BAS-ELISA：近年来对酶免设分析法的改进是使用生物素-亲合素-过氧化物酶复合物作为指示剂，组成一新的生物放大系统进一步提高检测的敏感度。可用来检测多种抗原抗体系统如细菌、病毒、肿瘤细胞表面抗原等。一个亲合素（avidin）分子可以结合4个生物素分子（biotin）。结合非常稳定。亲合素和生物素都可与抗全、酶、荧光素等分子结合，而不影响后者的生物活性。一个抗体分子可偶联90个生物素分子，通过生物素又可连接多个亲合素。因此大提高检测的敏感度。目前应用生物-酶标亲合素系统（biotinavidin system- ELISA,BAS-ELISA），它是通过生物素标记抗体连接免疫反应系统，同时借助生物素化酶或酶标亲合素引入酶与底物反应系统。

㈡ elisa 生物素标记多克隆抗体还是单克隆抗体较好

其实生物素只是充当一种显色的介质，和亲和素具有较强的亲和力，看你检测体系是需要用多克隆和单克隆吧，应该没多大区别

㈢ 生物素标记的抗体 选用哪种免疫组化染色

标记亲合素-生物素法（LAB法）

㈣ 为什么免疫组化染色ABC法比SP法更灵敏

可以看下面这个示意图：

如果没有生物素，链霉亲和素上带有的HRP酶是有限的，因为两个蛋白都有一定的空间结构，空间位阻可能会导致蛋白的某些生物学功能丧失，所以链霉亲和素能够偶联上的HRP数量受限。但是如果用生物素标记HRP，再把生物素-HRP与链霉亲和素一起孵育，这个时候是两个蛋白被生物素这个小分子连接，一个链霉亲和素可以和4个生物素结合，假设完全理想的状态，二抗的生物素占去一个位点，还有3个位点可以结合带有生物素的HRP，也就是变成了一分子链霉亲和素带有3分子的HRP，酶量增加了，当然灵敏度也就相应的提高了。

㈤ 如何用生物素标记抗体

缓冲溶液的作用主要就是pH稳定性和离子强度的适合，还有避免缓冲溶液中的成分与样品分子发生共价链接，主要就是考虑这些。
链接很容易，就用EDC或者CMC等碳二亚胺，是最容易在羧基和氨基之间催化形成酰胺键，反应条件就是0到4度，过夜，用磁力搅拌子温和搅拌，pH<7反应快，不过pH=7或稍微pH>7也关系不大。EDC或者CMC等碳二亚胺催化活性极高，而且一般的蛋白质的分子表面总有Lys,Arg,Asn,Gln，所以游离在分子表面的羧基和氨基总是不少的，参与反应的两种蛋白质用大致10：1的比例混合（哪种蛋白质便宜，哪种蛋白质的物质的量就大些，但是这不是全部原因），反应样品浓度就按照平时使用时的浓度或略微更低浓度（别用储存液的浓度）即可。很容易反应，而且EDC或者CMC等碳二亚胺是零臂连接试剂，用于空间位阻，形成多分子交联可能较小，即使形成了也很容易用分子筛层析按照分子量区分开。
参与反应的两种蛋白质用大致10：1的比例混合（哪种蛋白质便宜，哪种蛋白质的物质的量就大些，但是这不是全部原因），为了避免两种蛋白质之间发生交联成为串联，因为一种蛋白质形成串联的可能性低一些；即使要形成串联的蛋白质串珠，最好也不要是价格高的那种；另外，EDC或者CMC等碳二亚胺催化活性极高，室温下即会催化，所以要在0到4度，过夜，用磁力搅拌子温和搅拌，一方面避免碳二亚胺催化活性太高形成串联的蛋白质串珠，另一方面，保护蛋白质不变性；反应样品浓度就按照平时使用时的浓度或略微更低浓度（别用储存液的浓度）即可，为什么？因为浓度高了更易形成串联的蛋白质串珠结构，浓度低了，没有反应成功，通过分子筛层析还可以分离出来接着连接，如果形成了酰胺键再要专一性切开就没有那么容易了。

㈥ 过生物素标记的流式抗体及链霉亲和素标记的荧光素吗

过生物素标记的流式抗体及链霉亲和素标记的荧光素
抽血检测，一般用三代酶联合免疫法 酶联免疫法，简称ELISA。 它的中心就是让抗体与酶复合物结合，然后通过显色来检测。 步骤：ELISA用血清来检测，首先血液要经过至少半个小时的凝集，然后取血清（这是有些网友不理解为什么医院抽完了血对血置之不理的原因，其实是误会）。将酶复合物用稀释液稀释后，加血清及阴性、阳性对照，还有就是质控品（这是严格的要求，它的范围必须在质控范围内）。经过一个小时的孵育，然后洗板，加底物，半个小时避光反应后加终止液即完成反应部分，然后就是读数。由数值来判断结果的阴性或阳性。严格的讲，如果第一次检测为阳性的话，无论是哪个实验室，必须按照CDC的HIV操作规程来进行第二次检测，第二次的方法必须与第一次的不同，如还是阳性，将送确认实验室确认。有的医院很不负责，将初筛阳性的报告发出后就不管了，这是不对的。必须经过确认实验室确认后才可出阳性诊断。祝大家。PS，第一次检测为阳性的话，一定要去确认实验室再做一次，勇敢的去面对，也许结果就不一样了。 基本原理是：使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。

㈦ 荧光二抗标记用HRP、AP、FITC、生物素法各发什么颜色荧光

这四个不是一码事，HRP和AP是酶，二抗上挂了酶，要给相应的底物才能显色，显色方式可以通过发荧光也可以不发荧光（例如给予ECL底物，其中的H2O2和鲁米诺在HRP的作用下，能在黑暗中发出荧光；也可以给予双氧水和DAB，反应产生棕色不溶于水的物质）；FITC为异硫氰酸荧光素，本身就是黄绿色荧光，二抗结合后可直接在荧光显微镜下观察；生物素一般也是挂在二抗上的，利用卵白素分别连接生物素标记的第二抗体和生物标记的酶，由酶催化底物，生成终产物，这个终产物也是不溶于水的。

㈧ 免疫组化一抗+生物素化的二抗+DAB显色，这属于什么方法

SP，但其实和ABC基本原理是一样的，生物素化的二抗孵育之后还需要一步是用HRP（或者其他酶类）标记的链霉卵白素复合物孵育使其与生物素结合，然后和DAB反应的是HRP。简单来说就是：一抗--生物素化二抗结合一抗种属IgG--带HRP链霉卵白素结合生物素--DAB与HRP反应显色。

㈨ 蛋白marker为什么能作为显色条带

蛋白marker可分为：一、未预染的Marker即宽分子量蛋白标准、高分子量蛋白标准以及低分子量蛋白标准;二、预染的Marker即单色预染和多色预染。

在western Blot过程中，分子量Marker就像个螺丝钉一样没虽然是个小细节，然而就是这样一个小细节对实验结果有着不可忽视的作用。这个 Western Blot参照家族的一员的作用主要是用来指示蛋白条带所对应的分子量大小，只有标准量精确无误了，实验结果才有说服力，除此之外，蛋白标准还有表示转移成功或者蛋白在凝胶上的电泳程度等等的作用，所以选择正确的蛋白Marker也是western blot实验成功的必要条件之一。

总体来说，蛋白分子量标准可以分成未染蛋白分子量标准、预染蛋白分子量标准二个级别。以下是关于蛋白分子量标准的小叙：

一. 未染色(pre mixed)蛋白分子量标准

未染色的蛋白分子量标准是最简单，也是最准确的一种。由于没有附带染料分子或者是标记分子，所示大小正好是蛋白原本的大小，是精确判断蛋白大小必须的。现在的marker多数都选用预混和的Marker，方便不同大小的蛋白比较。预混的Marker通常有几条带加倍浓度作为指示，因为混合的条带越多，越不好记，谁知道哪条是那条!数到眼都花了。所以当看到特别浓的那几条标志带就记得是哪里了。不过要记得，小带通常都不那么容易看清楚的。在选择上来说，当然是选择其中至少有一条条带和自己的目的蛋白大小相近的最好，越近越好。如果你的蛋白不幸在两条跨度较大Marker条带之间，选别的Marker吧。预混的Marker使用上不如预染Marker(pre-stained)好用，因为电泳过程中完全看不到，要和目标蛋白一起等到最后染色才“开蛊”，无法对实验起预示参照作用。完全属于“后知后觉”型的，当然还是比“不知不觉”不做对照的要好。

① 宽分子量蛋白标准

如果从实验室总体考虑的，就选范围尽量宽，条带分布比较均匀的，这样你的蛋白无论在哪个区间都容易判断，避免正好落在一段空白区的危险。不过条带越多，每次上样量也就越费。拿到Marker后，如果买的是大包装，就应该考虑分装。多次反复冻融对于蛋白的危险，不用多说吧。另外要记得，宽谱的Marker不一定每条都能看到的，特别是Mini Cell。如果侧重大蛋白，那小的可能就已经跑掉了，不是质量不好哦。

② 高分子量蛋白标准

通常在检测大分子量蛋白经常使用到高分子量蛋白标准，

③ 低分子量蛋白标准

在一般的蛋白电泳当中，更常用的是低蛋白标准分子量，除了有指示蛋白大小的作用以外，有时还可以用作粗略的定量。实验室用在一般蛋白电泳的低分子量蛋白标准中。

在低分子量蛋白标准这里还包括可特别小的蛋白标准，比如30kD以下蛋白或者多肽的分离辨别。其中GE的从2kD到16kD之间有6条带的蛋白标准挺不错，另外提醒一句，特别小的蛋白Marker条带如果要显色好，上样一定要上足够的量哦。

二.预染蛋白分子量标准

预染蛋白分子量是一些纯化好的蛋白混合物，通过与染料共价耦联，在电泳过程中或者转膜时可以直接观察到。预染蛋白分子量的出现方便了我们的实验，这种蛋白分子量标准可以帮助我们在电泳时、电泳后，以及转膜后监测电泳情况和估计迁移率——比如，已知垂直电泳最佳分辨区域大约在胶的2/3处，如果使用预染Marker就可以预测目标蛋白进入最佳分辨区时停止电泳以得到最佳分辨效果;如果观察到Marker电泳异常也可以及时终止电泳;另外在Western Blot转膜以后可以直接观察蛋白转膜是否完全，还可以在膜上标记蛋白分子量，所以吸引了许多实验室人员购买预染蛋白标准。值得注意的是预染蛋白Marker与染料共价耦联，所以在不同的缓冲条件下电泳时迁移特性可能会发生某些变化，可能导致一些偏差，所以不太适合精确定位蛋白——不过多数情况下Marker的条带未必能和我们的目标蛋白完全一样，我们得到的也不过是一种相对Marker指示的参考大小，最后都需要Western来定性，所以如果不是要区分大小相近的条带，预染Marker还是很好用的，而且也可以和未染色的蛋白标准一起使用。

预染蛋白标准可以分为两种：单色预染和多色预染，其实区别就在于帮助在实验过程中辨认某个条带的大小——Marker条带越多参考价值越大，可就越难辨认区分，如果用不同的颜色来区别就比较好辨认啦。如果沉闷的电泳实验中跑出五颜六色的彩虹Marker，此时心情想必会愉快一些!单色的Marker通常是利用其中某些条带加倍浓度来提示其大小的。还有一点特别要注意，由于转膜是一个将胶里的Marker浓缩在洁白的膜上，所以需要的上样量相对少一些，如果想要在电泳过程中看到美丽的“彩虹”，或者单色的Marker往往需要比说明书里多加一些Marker的。

三、Western专用的蛋白分子量标准

①生物素标记蛋白标准

未染色的Marker在做Western时，需要在印迹前先用丽春红或者是SYPRO荧光蛋白染色液等不干扰Western Blot的染色方法显色，在胶上做标记最后才能“拼”在最后的结果中，如果是预染的Marker就要在转膜后标记膜，或者剪膜，最后在“拼上”。要是想直接将Marker结果显示在最后结果上，不用手工作图或者拼接，那就要Western专用的Marker了。比如生物素标记的蛋白标准。这种方法主要是配合化学发光法：在蛋白分子量上标记生物素，通过带有抗生物素的抗体或者偶联链亲霉素的抗体，在化学发光检测到目的蛋白带时就可以同时看到相应的分子量标准一起发光显影了。不同于普通蛋白分子量标准的便宜、预染蛋白分子量的方便，这一方法的优点是与Marker和目的蛋白对应性好，同时在同张片上显示，不用拼接，利于分析。缺点是如果样品中带有生物素背景，那个抗生物素抗体有可能影响结果，而且反应体系太过复杂也会干扰实验结果。

②特殊标记蛋白标准

在经过修饰的蛋白标准中，除了生物素标记以外，近些年由于下游蛋白操作的丰富化与复杂化，也出现带有“尾巴”的蛋白标准。比如His-Tag，如果每个Marker条带都有His –tag，那二抗添加His-Taq抗体很容易将Marker条带显示在Western结果上。很方便，问题就是有可能有潜在的干扰，比如样品中正好有类似Histag的结构。不过这可以通过对照检测的。